This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Anlagenteil Integrität Pflege ist wichtig für an der Zell-, Gewebe- detaillierten anatomischen Strukturen zu studieren oder sogar Organebene. Allerdings haben einige Pflanzenzellen starren Zellwände, zähen Fasern und Kristallen (Calciumoxalat, Siliciumdioxid, etc.) und mit hohem Wassergehalt , die stören oft Gewebeintegrität während des Schneidens Pflanzengewebe.
Diese Studie stellt eine einfache Hybrid-Cut Gewebe Schnittverfahren. Dieses Protokoll modifiziert eine Paraffinbasis Sektionieren Technik und verbessert die Integrität von Gewebeschnitten aus verschiedenen Pflanzen. Pflanzengewebe wurden in Paraffin eingebettet, bevor bei -16 ° C in einem Kryostaten sectioning. deutlich Sectioning bei niedrigen Temperaturen gehärtet, um die Paraffinblöcke, reduziert Reißen und Kratzen und eine verbesserte Gewebeintegrität. Dieses Protokoll wurde erfolgreich sowie widerspenstigen Gewebe wie reproduktives orga zu Kalziumoxalat-reiche Phalaenopsisorchidee Gewebe aufgetragenns und Blätter von Reis, Mais und Weizen. Darüber hinaus könnte die hohe Qualität von Gewebeschnitten von Hybrid-Cut in Kombination verwendet werden , mit in – situ – Hybridisierung (ISH) räumliche Expressionsmuster von Genen von Interesse bereitzustellen. Abschließend ist dieses Protokoll besonders nützlich für die widerspenstigen Pflanzengewebe mit einem hohen Kristall oder Silica-Anteil. Gute Qualität Gewebeschnitte ermöglichen morphologische und andere biologische Studien.
Die Paraffinbasis Schnittverfahren ist eine weit verbreitete Technik für anatomische Studien. Erhaltung der intakten Gewebes Anatomie ist wichtig für die morphologische und biologische Untersuchungen. Das Paraffin eingebettete Schnitte Technik ist vorteilhaft, da Paraffineinbettung Zell- und Gewebemorphologie behält. Zusätzlich Paraffinblöcke können bequem für längere Zeit gelagert werden. Allerdings, in Paraffin eingebettete Schnitte ist für Pflanzengewebe enthält, intrazellulär Kristalle nicht geeignet. Kristalle innerhalb der Zellen häufig Paraffin Bänder und Gewebe schädigen Integrität reißen während des Schneidens.
Im Gegensatz zu Paraffin Schneide ist Kryoschneiden relativ schnell und Abschnitte können ohne Fixierung, serielle Dehydratation oder Einbettmediums Infiltration 1 erhalten werden. Kryoschnitte sind kompatibel mit vielen Anwendungen , wie der Immunhistochemie, Hybridisierung in situ, und Enzymhistochemie. Der andere Vorteil von Kryoschneiden istdaß dieses Verfahren geht nicht durch ein Spannungs Denaturierung Prozesse wie hohe Temperatur und chemischen Behandlungen werden so zelluläre Moleküle gut innerhalb der Gewebeabschnitte 2 erhalten. Kryoschneiden ist im allgemeinen bevorzugt über Paraffinbasis für Studien in tierischen Geweben sectioning. Allerdings ist Kryoschneiden nicht die erste Wahl in Pflanzen, weil Gefriertemperatur manchmal Bildung von Eiskristallen verursacht, die die Qualität der Abschnitt Integrität beeinträchtigen. Obwohl osmoregulation wie Saccharoselösungen, Polyethylenglykol (PEG) oder Glycerin – 3 berichtet Kristall Eisbildung unter Gefrierbedingungen zu verringern, ist die Verbesserung geringer als optimal.
Zur Anpassung an unterschiedliche Umgebungen, verschiedene Pflanzen haben oft unterschiedliche Gewebebeschaffenheit und Pflanzenzellen entwickelt haben starren Zellwände, zähen Fasern zu bilden, und Kristalle 4,5. Zum Beispiel sind unlösliche Kalziumoxalatkristallen und Kieselkörper relativ häufig inPflanzen 6. Silicate Körper / Kristalle wurden berichtet wird, um Anlagenarchitektur erhalten, Geradheit, und Verhütung von Krankheiten oder Schädlings in Getreidepflanzen 7-9.
Die Topf Orchideen und Schnittblumen Orchidee Markt floriert und es ist eine wachsende Branche. Phalaenopsis aphrodite (Phalaenopsis) ist einer der wichtigsten Export Zierpflanzen in Taiwan. Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen , um die morphologischen und physiologischen Veränderungen der Blüten Prozesse in Phalaenopsisorchideen zu verstehen gemacht. Floral Spitzen von Phalaenopsisorchideen aus Achselknospen an der Blattbasis eingeleitet. Nach einer Zeit der kühlen Umgebungstemperatur (etwa eineinhalb Monate), Achselknospen vergrößern, brechen dormancy und ragen aus dem Blattbasis in jungen Blumenspitzen zu entwickeln. Um die physiologischen verstehen, zellulären und molekularen Prozesse der Spitze Initiation ist es wichtig, eine stabile anatomische Technik zu entwickeln, um Visualize Gewebe oder Marker in einer angemessenen Weise. Doch das Vorhandensein von allgegenwärtigen Kristalle in Orchidee Geweben, insbesondere in Achselknospen, macht anatomische Arbeit schwierig.
Hier haben wir versucht, Abschnitt Integrität von widerspenstigen Pflanzengewebe zu verbessern, die als technisch anspruchs bisher angesehen wurden. Hier zeigen wir ein verbessertes Protokoll namens Hybrid-Cut. Es ist ein Paraffinbasis Schnittverfahren, das einen Kryostaten durchgeführt wird. Paraffinausgießstation löst mit hohem Wassergehalt in Pflanzengewebe. Sectioning bei niedrigen Temperaturen härtet der Paraffinblock, reduziert Kristall Problem zu reißen, und die Integrität Gewebe erheblich verbessert. Dieses Protokoll deutlich verbessert die Gewebeintegrität für widerspenstige Pflanzenproben.
Pflanzenzellen haben starren Zellwände, zähen Fasern, Kristalle und hohem Wassergehalt, die Gewebe Zerreißen Probleme bei Pflanzengewebe Schnitte verursachen. Obwohl Paraffinbasis Sektionieren häufig für Pflanzengeweben verwendet wird, zerreißen die endogene Kristalle oft das Pflanzengewebe während des Schneidens (Abbildung 1). Aufgrund der von Natur aus hohen Wassergehalt innerhalb der Pflanzenzellen, Kryostat-basierte Schnitte verursacht häufig gebrochene Zellen und rissig Gewebeschnitten.
In der vorliegenden Studie wird eine kombinierte Paraffineinbettung und Kryoschnittes Protokoll Hybrid-Cut genannt wurde entwickelt und gute Qualität Gewebeschnitte wurden erhalten. Dieses Protokoll löst das Problem mit hohem Wassergehalt assoziiert durch Paraffineinbettung Einführen und verringert die Reißwirkung durch während des Schneidens (Abbildung 3) Paraffinwachs bei niedriger Temperatur aushärtet. Daher ist dieses modifizierte Protokoll vorteilhaft entweder über Paraffinbasis Sectioning oder Kryoschneiden Pflanzengewebe Integrität zu bewahren.
Dieses Manuskript zeigt , dass die Hybrid-Cut – Verfahren bewahrt Gewebeintegrität in vielen Geweben von Phalaenopsis – Orchideen wie Achselknospe, Samen und PLB, etc., die ein hohes Maß an Kristallen (Abbildungen 3-4) enthalten. Darüber hinaus ist dieses Protokoll zugänglich Getreidekulturen wie Fortpflanzungsorgane und Blätter von Reis, Mais und Weizen , die mit hohem Siliciumdioxidgehalt (Abbildungen 5-6) enthalten. Vermutlich kann dieses Protokoll angewendet werden, um Pflanzen zu holzig hohe Faser enthält.
In der Regel gründlich Festsetzung Gewebe ist sehr wichtig für Hybrid-Cut. Wir fanden , dass Formaldehyd-Alkohol-saure Säure (FAA) Fixiermittel besser ist als PFA die Gewebeintegrität von einigen widerspenstigen Geweben wie axial Knospen, Wurzeln, etc. Allerdings, PFA funktioniert besser als FAA bei der Erhaltung der RNA – Integrität zu erhalten. Daher wird empfohlen, PFA zu behebenProbe für die in – situ – Hybridisierung (ISH) Arbeit. Das hier beschriebene Protokoll wird für RNA ISH Experiment entworfen. Daher wurden alle Reagenzien hergestellt RNA-Abbau zu vermeiden, durch RNase Kontamination durch DEPC Behandlung beseitigt werden. Wenn Hybrid-Cut Abschnitt ist für anatomische Studien, regelmäßige Umkehrosmose (RO) Wasser und die davon abgeleiteten Puffer oder Reagenzien sind akzeptabel.
Reduktionsprobengröße und der Dicke auf weniger als 3 mm ist für die Infiltration hilfreich. Außerdem sind zunehmende Tauchzeit zur Entwässerung und Infiltration für harte Textur Gewebe notwendig. Begrenzung dieses Protokoll könnte Probleme aufgrund von unzureichender Fixierung verursacht, Dehydrierung und Infiltration der Probe. Daher Einstellung der Verarbeitungszeit für jeden Schritt ist entscheidend für gute Qualität Paraffinblock zu erzeugen. Normalerweise braucht härtere Gewebe längere Bearbeitungszeit als weicher Gewebe.
Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Hybrid-Cut erfolgreich in Kombination wi gearbeitetth ISH räumliche Verteilung der ausgewählten Transkripten (Figur 7) bereitzustellen. Zusammenfassend ist dieses Protokoll für die Untersuchung der Pflanzenanatomie und stellt eine gewebespezifische RNA Karte der ausgewählten Gene nützlich. Zusätzlich kann es andere molekulare Studien wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay, Fluoreszenz – in situ – Hybridisierung (FISH) und Immunfärbungstechniken angewendet werden. Im Ergebnis ist dies eine verbesserte Gewebeschneide Protokoll sowohl nützlich und hilfreich für Forscher in Pflanzengemeinschaften.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |