This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
סעיף צמח שמירה על שלמות חיונית ללימוד מבנים אנטומיים מפורטים על הסלולר, הרקמות, או אפילו ברמת איברים. עם זאת, תאים ולשתול יש קירות תא נוקשים, סיבים קשים וקריסטלים (סידן אוקסלט, סיליקה, וכו '), ואת תכולת מים גבוהה כי לעתים קרובות לשבש שלמות רקמות במהלך חתך רקמות הצמח.
מחקר זה קובע שיטת חתך רקמות פשוט חותך-היברידיות. פרוטוקול זה משנה טכניקת חתך מבוסס פרפין משפר את שלמות סעיפי רקמות מצמחים שונים. רקמות צמח היו מוטבעות פרפין לפני החתך בתוך cryostat ב C -16 °. חתך מתחת לטמפרטורה נמוכה מוקשה האבנית פרפין, קריעה מופחתת מגרדת, שלמות רקמות השתפרה משמעותית. פרוטוקול זה יושם בהצלחה לרקמות סחלב Phalaenopsis עשירי סידן אוקסלט וכן רקמות סרבניות כגון orga רבייהns ועלים של אורז, תירס, חיטה. בנוסף, באיכות גבוהה של קטעי רקמה מן-Cut היברידי יכול לשמש בשילוב עם הכלאה באתרו (שאני עורך) כדי לספק דפוסי הביטוי המרחבי של הגנים של עניין. לסיכום, פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור רקמות צמח סרבניות המכילות תוכן קריסטל או סיליקה גבוה. איכות טובה סעיפי רקמות לאפשר מחקרים ביולוגיים מורפולוגיים אחרים.
שיטת החתך מבוסס פרפין היא טכניקה בשימוש נרחבת עבור מחקרים אנטומיים. שימור האנטומיה רקמות שלמות חשוב ללימודי מורפולוגיים וביולוגיים. הטכניקה חתכה-מוטבע פרפין יש יתרון משום-הטבעת פרפין שומרת מורפולוגיה תאים ורקמות. בנוסף, בלוקי פרפין ניתן לאחסן בנוחות לתקופות זמן ארוכות. עם זאת, חתך-מוטבע פרפין אינו מתאים רקמות הצמח המכיל גבישי תאיים. קריסטלים בתוך התאים לעתים קרובות לקרוע סרטים פרפין שלמות רקמות נזק במהלך חתך.
בניגוד חתך פרפין, cryosectioning הוא מהיר יחסית וחתכים ניתן להשיג ללא קיבוע, התייבשות סדרתי או הטבעה חדירה 1 בינוני. Cryosections תואם יישומים רבים כגון אימונוהיסטוכימיה, כלאה באתרו, ואנזים היסטוכימיה. היתרון השני של cryosectioning הואהשיטה זו אינה עוברת תהליכי denaturation פוטנציאל כגון טמפרטורה גבוהה טיפולים כימיים, כך מולקולות הסלולר נשמרות היטב בתוך קטעי הרקמה 2. Cryosectioning מעדיף בדרך כלל מעל מבוססי פרפין חתך ללימודים ברקמות בעלי חיים. עם זאת, cryosectioning הוא לא הבחירה הראשונה בצמחים כי טמפרטורה מקפיאה לפעמים גורם להיווצרות גבישי קרח המשפיעים על איכות שלמות סעיף. למרות ויסות האוסמוטי כגון פתרונות סוכרוז, פוליאתילן גליקול (PEG), או גליצרול 3 דווחה להפחית היווצרות קרח קריסטל בתנאי הקפאה, השיפור רחוק מלהיות אופטימלי.
כדי להסתגל לסביבות שונות, צמחים שונים יש לעתים קרובות תאי מרקם צמח רקמות ברורים התפתחו כדי ליצור קירות תא נוקשים, סיבים קשים, וקריסטלים 4,5. לדוגמא, גבישים אוקסלט מסיסים וגופים סיליקה הם די נפוציםצמחים 6. גופי סיליקט / דווחו גבישים כדי לסייע לשמור על אדריכלות צמח, תְמִירוּת, ולמנוע מחלות או מזיקים בצמחי דגנים 7-9.
הסחלבים בעציץ וחותך-הפרח בשוק הסחלב פורח וזה ענף צומח. אפרודיטה Phalaenopsis (סחלב עש) היא אחד צמחי נוי יצוא החשובים ביותר בטייוואן. במאמצים משמעותיים נעשו כדי להבין את השינויים מורפולוגיים פיסיולוגיים של התהליכים הפורחים סחלבי Phalaenopsis. קוצים פרחוניים של סחלבי Phalaenopsis יזומים מן ניצני בית השחי בבסיס עלה. לאחר תקופה של טמפרטורת סביבה מגניבה (כ אחת וחצי חודשים), בלוטות בית השחי להגדלה, לשבור תרדמת, ו לבלוט מהבסיס עלה להתפתח קוצים פרחוניים צעירים. כדי להבין את פיזיולוגיים, הסלולר, ותהליכים מולקולריים חניכת ספייק, זה הכרחי כדי לפתח טכניקת אנטומיים חזקה כדי visuaרקמות או סמנים Lize מבעוד מועד. עם זאת, הנוכחות של גבישים בכל מקום ברקמות סחלב, במיוחד ניצני בית השחי, עושה עבודה אנטומיים קשה.
כאן אנו בקשנו לשפר שלמות סעיף של רקמות צמח סרבניות כי כבר ראו עד כה מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול משופר בשם Hybrid-Cut. זוהי שיטת חתך מבוסס פרפין כי מתבצעת באמצעות cryostat. הטבעת פרפין פותר תכולת מים גבוהה ברקמות צמח. חתך מתחת לטמפרטורה נמוכה מקשה את בלוק פרפין, מפחית קריסטל קורע בעיה, ומשפר שלמות רקמות משמעותית. פרוטוקול זה משפר שלמות רקמות משמעותית עבור דגימות צמח סרבניות.
יש צמחי תאים קירות תא נוקשים, סיבים קשים, קריסטלים, ואת תכולת מים גבוהה כי לגרום לבעיות קריעת רקמות במהלך חתך רקמות צמח. למרות חתך מבוסס פרפין משמש לעתים קרובות עבור רקמות צמח, את הגבישים אנדוגני לעתים קרובות לקרוע את רקמת הצמח במהלך החתך (איור 1). בגלל תכולת מי מטבעם הגבוה בתוך בתאי הצמח, חתך מבוסס cryostat לעתים קרובות גורם לתאי שבור וחתכי רקמות סדוקים.
במחקר הנוכחי, פרוטוקול פרפין הטבעה ו cryosection בשילוב בשם Hybrid-Cut פותח וקטעי רקמה באיכות טובות התקבלו. פרוטוקול זה פותר את הבעיה קשורה תכולת מים גבוהה על ידי החדרת הטבעת פרפין, ומצמצם את אפקט הקריעה על ידי הקשחת פראפין תחת בטמפרטורה נמוכה במהלך החתך (איור 3). לכן, פרוטוקול שונה זו יש יתרון על פני משני sectio פרפין המבוססנינג או Cryosectioning עבור שמירה על שלמות רקמות הצמח.
כתב יד זה מדגים כי השיטה ההיברידית-Cut משמר שלמות רקמות ברקמות רבות של סחלב Phalaenopsis כגון ניצן השחי, זרע, ו PLB, וכו 'המכילות רמות גבוהות של גבישים (איורים 3-4). יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן פלח כגון איברי רבייה ועלים של אורז, תירס, חיטה המכילים סיליקה גבוהה (איורים 5-6). יש להניח, פרוטוקול זה ניתן להחיל את וודי צמחים המכילים סיבים תזונתיים גבוהים.
באופן כללי, רקמת תיקון ביסודיות חשובה מאוד על Cut ההיברידי. מצאנו כי חומצת פורמלדהיד-חומצי-אלכוהול (FAA) מקבע עדיף PFA כדי לשמור על שלמות הרקמה של רקמות סרבניות מסוימות כגון בלוטות axially, שורשים, וכו 'עם זאת, PFA עובד טוב יותר מאשר ה- FAA בשימור שלמות RNA. לכן PFA מומלץ לתקןמדגם עבור כלאה באתרו (שאני עורך) עבודה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לניסוי RNA שאני עורך. לכן, כל ריאגנטים הוכנו כדי למנוע השפלה RNA על ידי ביטול זיהום RNase ידי טיפול DEPC. אם סעיף Hybrid-Cut הוא ללימודי אנטומיים, אוסמוזה ההפוכה רגילים (RO) מי חיץ הנגזרות שלה או ריאגנטים כשרים.
צמצום דגימת גודל ועובי כדי פחות מ -3 מ"מ מועיל עבור חדירה. יתר על כן, זמן טבילה גובר התייבשות וחדירה נחוץ רקמות מרקם קשות. הגבלת פרוטוקול זה עלולה עקב בעיות שנגרמות על ידי קיבעון לקוי, התייבשות, וחדירה של דגימה. לכן, התאים זמן עיבוד בכל צעד קריטי לייצר בלוק פרפין באיכות טובה. בדרך כלל, רקמה קשה צריכה עוד זמן עיבוד מאשר רקמה רכה.
בנוסף, הראינו כי Hybrid-Cut עבד בהצלחה wi שילובשאני עורך ה לספק פריסה המרחבית של התמלילים שנבחרו (איור 7). לסיכום, פרוטוקול זה שימושי לחקר אנטומיה של צמח ומספק מפת RNA ספציפי רקמות של הגנים הנבחרים. בנוסף הוא עשוי להיות מיושם על מחקרים מולקולריים אחרים כגון תיוג סוף מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק (TUNEL) assay, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), וטכניקות immunostaining. לסיכום, פרוטוקול חתך רקמות משופר זו הוא גם שימושי ומועיל לחוקרים בקהילות צמח.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |