This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Le maintien de la section centrale de l'intégrité est essentielle pour l'étude des structures anatomiques détaillées au niveau cellulaire, des tissus, ou le niveau même organe. Cependant, certaines cellules végétales ont des parois cellulaires rigides, des fibres dures et cristaux (oxalate de calcium, silice, etc.), et de haute teneur en eau qui perturbent souvent l' intégrité des tissus pendant la coupe des tissus végétaux.
Cette étude établit une méthode de sectionner tissu hybride-Cut simple. Ce protocole modifie une technique de découpe à base de paraffine et améliore l'intégrité des coupes tissulaires provenant de différentes plantes. Les tissus végétaux ont été inclus dans la paraffine avant sectionnant dans un cryostat à -16 ° C. Sectionnement sous basse température trempé les blocs de paraffine, déchirure réduite et gratter, et l'intégrité des tissus améliorée de manière significative. Ce protocole a été appliqué avec succès à des tissus d'oxalate de calcium riche Phalaenopsis orchidées ainsi que les tissus récalcitrants tels que les orga reproductivens et les feuilles de riz, le maïs et le blé. En outre, la qualité des coupes de tissus de coupe hybride peut être utilisé en combinaison avec l' hybridation in situ (ISH) pour fournir des profils d'expression spatiaux des gènes d'intérêt. En conclusion, ce protocole est particulièrement utile pour les tissus végétaux récalcitrants contenant haute cristal ou teneur en silice. coupes de tissus de bonne qualité permettent des études biologiques morphologiques et autres.
Le procédé de découpe à base de paraffine est une technique largement utilisée pour des études anatomiques. La préservation de l'anatomie des tissus intacts est important pour les études morphologiques et biologiques. La technique de découpe paraffine est avantageuse car la paraffine-plongement conserve cellulaire et tissulaire morphologie. En outre, des blocs de paraffine peuvent être stockés commodément pendant de longues périodes de temps. Cependant, le sectionnement inclus dans la paraffine ne convient pas pour les tissus végétaux contenant des cristaux intracellulaires. Cristaux dans les cellules se déchirent souvent des rubans de paraffine et de l'intégrité des dommages aux tissus pendant la coupe.
Contrairement à la paraffine tronçonnage, cryosectioning est relativement rapide et sections peuvent être obtenues sans fixation, déshydratation serial ou milieu d' inclusion infiltration 1. Des cryosections sont compatibles avec de nombreuses applications telles que l' immunohistochimie, l' hybridation in situ, et l' enzyme histochimie. L'autre avantage de cryosectioning estque cette méthode ne passe pas par un processus de dénaturation potentiels tels que la température et les traitements chimiques, les molécules de sorte cellulaires sont bien conservés dans les sections de tissu 2. Cryosectioning est généralement préférée à base de paraffine sectionnant pour les études dans les tissus animaux. Cependant, cryosectioning est pas le premier choix dans les plantes, car la température de congélation provoque parfois la formation de cristaux de glace qui affectent la qualité de l'article intégrité. Bien que osmorégulation telles que des solutions de saccharose, le polyéthylène glycol (PEG) ou le glycérol 3 ont été rapportés pour réduire la formation de cristaux de glace dans des conditions de congélation, l'amélioration est moins qu'optimale.
Pour adapter à différents environnements, différentes plantes ont souvent des cellules de texture des tissus et végétales distinctes ont évolué pour former des parois rigides cellulaires, fibres dures, et des cristaux de 4,5. Par exemple, insolubles des cristaux d'oxalate de calcium et corps de silice sont assez communs dans6 plantes. Organismes Silicate / cristaux ont été signalés pour aider à maintenir l' architecture des plantes, droiture, et prévenir la maladie ou d'un parasite dans les plantes de céréales 7-9.
Les orchidées en pot et le marché des orchidées de fleurs coupées est florissante et il est une industrie en pleine croissance. Phalaenopsis aphrodite (orchidée papillon) est l' une des plantes ornementales exportation les plus importants de Taiwan. D' importants efforts ont été faits pour comprendre les changements morphologiques et physiologiques des processus de floraison dans les orchidées Phalaenopsis. Épis floraux d'orchidées Phalaenopsis sont initiées à partir de bourgeons axillaires à la base des feuilles. Après une période de température ambiante froide (environ un mois et demi), les bourgeons axillaires agrandir, dormance, et font saillie à partir de la base de la feuille de se développer en jeunes pointes florales. Pour comprendre l'état physiologique, cellulaire, et les processus moléculaires de pic initiation, il est essentiel de développer une technique anatomique robuste pour Visuades tissus ou des marqueurs liser en temps opportun. Cependant, la présence de cristaux omniprésents dans les tissus d'orchidées, en particulier dans les bourgeons axillaires, rend le travail anatomique difficile.
Ici, nous avons cherché à améliorer la section intégrité des tissus végétaux récalcitrants qui ont été jusque-là considérées comme techniquement difficile. Ici, nous montrons un protocole amélioré baptisé Hybrid-Cut. Il est un procédé de découpe à base de paraffine qui est réalisée à l'aide d'un cryostat. plongement Paraffine résout haute teneur en eau dans les tissus végétaux. Sectionner durcit à basse température du bloc de paraffine, réduit le cristal déchirement problème, et améliore de façon significative l'intégrité des tissus. Ce protocole améliore de manière significative l'intégrité des tissus pour les échantillons de plantes récalcitrantes.
Les cellules végétales ont des parois rigides cellulaires, fibres dures, des cristaux, et forte teneur en eau qui causent des problèmes de déchirement du tissu pendant la coupe des tissus végétaux. Même si tronçonnage à base de paraffine est fréquemment utilisée pour les tissus végétaux, les cristaux endogènes lacèrent souvent le tissu végétal pendant la coupe (Figure 1). En raison de la teneur élevée en soi de l'eau dans les cellules végétales, à base de tronçonnage cryostat provoque souvent des cellules cassées et des coupes de tissus fissurés.
Dans la présente étude, une paraffine-plongement et cryosection protocole combiné baptisé Hybrid-Cut a été développé et des coupes de tissus de bonne qualité ont été obtenus. Ce protocole résout le problème lié à la forte teneur en eau par l' introduction d' inclusion dans la paraffine, et réduit l'effet de déchirure par le durcissement de la paraffine à basse température pendant la coupe (figure 3). Par conséquent, ce protocole modifié est avantageux par rapport soit sectio à base de paraffinening ou cryosectioning pour préserver l'intégrité des tissus de la plante.
Ce manuscrit démontre que la méthode Hybrid-Cut préserve l' intégrité des tissus dans de nombreux tissus de Phalaenopsis orchidées telles que bourgeon axillaire, les semences, et PLB, etc. qui contiennent des niveaux élevés de cristaux (figures 3-4). En outre, ce protocole se prête aux cultures de céréales telles que les organes reproducteurs et les feuilles de riz, le maïs et le blé qui contiennent haute teneur en silice (figures 5-6). Vraisemblablement, ce protocole peut être appliqué aux plantes ligneuses contenant haute teneur en fibres.
En général, le tissu de fixation est bien très important pour Hybrid-Cut. Nous avons constaté que l' acide formaldéhyde-alcool-acide (FAA) fixateur est meilleure que PFA pour préserver l'intégrité des tissus de certains tissus récalcitrants tels que les bourgeons axialement, racines, etc. Cependant, PFA fonctionne mieux que la FAA à préserver l'intégrité de l' ARN. Par conséquent PFA est recommandé de fixeréchantillon pour l' hybridation in situ (ISH) travail. Le protocole décrit ici est conçu pour l'expérience ARN ISH. Par conséquent, tous les réactifs ont été préparés pour éviter la dégradation de l'ARN en éliminant la contamination RNase par traitement DEPC. Si l'article Hybrid-Cut est pour les études anatomiques, l'osmose inverse (OI) de l'eau ordinaire et son tampon ou des réactifs dérivés sont acceptables.
Réduction de la taille et de l'épaisseur de l'échantillon inférieure à 3 mm est utile pour l'infiltration. En outre, l'augmentation du temps d'immersion pour la déshydratation et l'infiltration sont nécessaires pour les tissus de texture dure. Limitation de ce protocole pourrait en raison de problèmes causés par une mauvaise fixation, la déshydratation et l'infiltration de l'échantillon. Par conséquent, l'ajustement du temps de traitement pour chaque étape est essentielle pour produire bloc de paraffine de bonne qualité. Normalement, un tissu plus dur nécessite un temps plus le temps de traitement de tissu mou.
En outre, nous avons montré que Hybrid-Cut a travaillé avec succès en combinaison wie ISH pour fournir une distribution spatiale des transcriptions sélectionnées (figure 7). En résumé, ce protocole est utile pour l'étude de l'anatomie des plantes et fournit un ARN carte spécifique au tissu des gènes sélectionnés. En outre , il peut être appliqué à d' autres études moléculaires tels que désoxynucléotidyltransférase terminale dUTP nick étiquetage final (TUNEL) dosage, l' hybridation fluorescente in situ (FISH), et les techniques de immunocoloration. En conclusion, cette amélioration de protocole de découpe de tissu est à la fois utile et utile pour les chercheurs dans les communautés végétales.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |