We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
kanser hücreleri ve çevresindeki kanserli olmayan stroma arasındaki erken heterotypic etkileşimleri anlamak stromal aktivasyonu ve tümör mikro-(TME) kurulmasına yol açan olaylar durulaştırmada önemlidir. In vitro ve TME vivo modellerde çeşitli geliştirilmiştir; Bununla birlikte, genel olarak bu modeller hali hazırda daha fazla çalışma, bozucu olmayan koşullar altında, tek tek hücre popülasyonlarının izole izin vermez. Bu zorluğu aşmak için, uzun bir co Ucun zarın her iki tarafında ayrı ayrı iyice büyümüş zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının kolay üretilmesi, fakat izin veren bir geçirgen mikro gözenekli membran geçme oluşan bir hücre büyütme alt-tabaka kullanılarak bir in vitro TME modeli kullanmışlardır -Kültür kez. Bu modelin kullanımı sayesinde, normal diploid insan fibroblastlarında den (CAF) popülasyonu aşağıdaki önemli ölçüde zenginleştirilmiş kanserle ilişkili fibroblast üretme yeteneğine sahiptirFloresan etiketleme ve / veya hücre sıralama kullanılmadan yüksek düzeyde metastatik insan göğüs karsinom hücreleri ile birlikte-kültür (120 saat). Ayrıca, ekin gözenek boyutu modüle ederek, biz gelişimini altında yatan mekanizmaların soruşturma izin iki heterotypic hücre popülasyonları arasındaki hücrelerarası iletişimi (örneğin, boşluk kavşak iletişim, salgılanan faktörler) modu için kontrol edebilirsiniz gap junction geçirgenliği rolü de dahil olmak üzere TME,. Bu model kanser stroma başlatılması, TME erken evrimi ve terapötik ajanlar kanser hücrelerinin yanıtları stroma modüle etkisi yol açan ilk olayların anlayışımızı arttırmak değerli bir araç olarak hizmet vermektedir.
tümör mikro (TME) arada var ve ev sahibi stroma yanında gelişmeye karsinom hücreleri oluşan son derece karmaşık bir sistemdir. Bu stromal bileşeni, tipik olarak fibroblastlar, miyofibroblastlar, endotel hücreleri, çeşitli bağışıklık bileşenlerinin, hem de hücre dışı bir matris 1 oluşur. Önemli bir bileşen, bu stroma genellikle çoğu, aktive edilmiş fibroblastlar, sıklıkla kanserle ilişkili fibroblast veya karsinoma ile ilişkili fibroblastlar (CAF) 2,3 olarak adlandırılır. Normal, aktif olmayan fibroblastlar aksine cafs meme, prostat, akciğer, pankreas, deri, kolon, özofagus olmak üzere karsinom, çok çeşitli tümör başlaması, ilerlemesi, anjiyogenez, invazyon, metastaz ve nüks 4-11 katkı ve 5,6,12-17 yumurtalık. Oysa, kanser patogenezinde boyunca cafs katkısı kesin doğası yetersiz tanımlanmış kalır. Ayrıca, klinik kanıtlar cafs bir prognostik değeri göstermiştirYüksek dereceli maligniteler, tedavi yetmezliği ve genel olarak kötü prognoz 10,18,19 kendi varlığını ilişkilendirilmesi.
Açıkçası, CAF geliştirme başlatılması olaylar yanı sıra TME içindeki rollerini aracılık hücrelerarası iletişim anlayışımızı geliştirerek, hasta sonuçlarını geliştirmek heyecan verici yeni tedavi hedefleri ve gelişmiş stratejileri sağlayabilir. Bu amaca yönelik olarak, in vivo ve in vitro modellerde çok geliştirilmiştir. In vivo yaklaşımlar hastaların TME daha yansıtıcı olmakla birlikte, içinde ve tümörler arasında hem muazzam karmaşıklığı ve heterojenliği dahil sınırlamalar sahiptirler. Ayrıca, insan denekler tümör örnekleri genellikle oldukça TME geliştirilen temsil ve TME başlatılması olayların bir anlayış izin vermez. Deneysel hayvan çalışmaları nedeniyle fiziksel durumları farklılıklardan ancak insanlara hayvan verilerinin genelleme dikkatli yapılmalıdır bazı avantajlar sunarBu tür kemirgenlerde (örn tiyol kimya 20, metabolizma hızı 21 tolerans vb 22 vurgulamak) olarak insanlar ve hayvanlar arasında ology. Ayrıca, doğada genetik olarak heterojen olan insan nüfusunun, aksine, laboratuvar hayvanları genellikle homojenlik için yetiştirilmektedir. Ayrıca, geçici fizyolojik değişimleri ve hücre fenotip değişiklikleri incelemek için, yanı sıra, kemirgenler gibi hayvan kullanarak belirli deneysel parametrelerin kontrol etmek için çoğu zaman zordur. Bu nedenle, in vitro, 2- ve 3-boyutlu (2D ve 3D) doku kültürü modelinde sık TME gelişmenin temel anlayışı ilerletmek için kullanılmaktadır. In vivo sistemlerinin karmaşıklığı doğru bir canlandırdığı onların eksikliği rağmen, bu modeller büyük ölçüde mekanik soruşturma kolaylaştırmak avantajlar sunmaktadır. In vitro modeller TME daha basitleştirilmiş odaklı ve uygun maliyetli analizi için, bu sayede istatistiksel olarak anlamlı izin veri oluşturulabilirhayvanlarda ortaya çıkan sistemik varyasyonlar serbest hücreleri.
In vitro sistemlerinde birçok çeşidi vardır. En sık kullanılan iki TME in vitro model karışık tek tabaka ya da sferoit hücre kültürleri içerir. Hem kültür yöntemleri arası etkileşimleri ve çeşitli TME spesifik hücre fenotipi değişikliklerin analizi için (tümör hücreleri ile, örneğin, normal hücreler) temel çalışmaları için avantajlıdır (örneğin normal fibroblastlardan kanserle ilişkili fibroblastlar ortaya çıkması). Ayrıca, küremsi TME daha yansıtıcı doku benzeri bir yapı oluşturmak edebiliyoruz, ve tümör heterojenliği 23 temsilcisi olabilir. Ancak sferoidler genellikle deneysel sonuçlar 24 zorlaştırabilir katmanlar arasında büyük ölçüde değişen oksijen basıncı geçişlerini, üretirler. Ne yazık ki, iki model son derece ko- aşağıdaki ileri karakterizasyon ve çalışma için saf hücre popülasyonlarının izole etme yeteneği sınırlıdırkültür. bu nedenle floresan etiketli veya tespit makinesi ile etiketlenmiş ve daha sonra hücre popülasyonları ayırmak için ayırma geniş işleme ve hücreye ko-kültür karıştırılır tabi olması için en azından bir hücre tipi gerektirecektir yapmak. Hücre sıralayıcı oldukça saf bir hücre popülasyonu izole edebilen birlikte, bir selüler stres ve muhtemel mikroplu kirliliklere farkında 25 riski olmalıdır.
Hücrelerarası iletişimi anlaşılmasını kolaylaştırmak için, büyük çabalar geliştirmek ve basitleştirilmiş bir yaklaşım izin yakından, in vivo ortamda taklit in vitro sistemlerde optimize edilmesine yönelik tahsis edilmiştir. Böyle bir alet geçirgen mikro gözenekli insert, ilk 1953 26 yılında geliştirilen ve daha sonra farklı uygulamalar ve çalışmalar (örneğin, hücre polarite 27 endositoz 28, uyuşturucu taşımacılığı 29, doku modelleme 30, fert için adapte edilmiş bir zar substratyonu 31 seyirci kalma etkisi 32,33, vs.). Bu sistem geçirgen olmayan plasticware üzerinde kültürlendiklerinde gözlenmez 34,35 işaretleyicileri in vivo birçok in vivo benzeri anatomik ve fonksiyonel farklılaşma hücrelerin büyümesini, hem de ifadeyi verir. Ayrıca, son derece ince gözenekli membran (10 mikron kalınlığında) in vivo ortamda taklit ve hem üst ve taban hücre etki bağımsız hücre işleyişini izin moleküller ve dengeleme kez hızlı difüzyon izin verir. zar, gözenekler içinden içi çeşitli iletişim modu koruyarak TME sistemi olarak ucun yardımcı ilave bir avantajı, aynı çevre koşulları zarın her iki tarafında yetiştirilen iki heterotipik hücre popülasyonlarının fiziksel olarak ayrılmasıdır. Fiziksel olarak ayrılmış olmasına rağmen, iki hücre popülasyonları metabolik de olduğu gibi, salgılanan elemanları üzerinden bağlandığı veAyrıca boşluk kavşak kanallardan, burada tarif. Ayrıca, in vivo kısmi oksijen basıncı da ekler (PO 2) sürdürerek, model diğer sistemlerde gözlenen oksijen ve kimyasal geçişlerini komplikasyonlarını azaltır. Aksine, bu TME kontrol doğal mekanizmaların anlaşılması artırır. Özellikle, iki hücre popülasyonları kolaylıkla eş-kültür uzun süreler aşağıdaki flüoresan etiketleme ve / veya hücre sıralama olmaksızın, yüksek saflıkta izole edilebilir.
Burada membran gözenekleri sayesinde, sürekli iki-yönlü iletişim henüz insan meme karsinoma hücreleri ve geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme her iki tarafında sırasıyla yetişkin insan fibroblastlarında oluşan bir in vitro TME protokol açıklar ama. Biz gösteriyor ki gelişimine farklı gözenek boyutları ile, hücrelerarası iletişimi belirli bir tip katkısı (gap junction karşı, örneğin salgılanan faktörler) membranlar kullanılarakTME araştırılabilir.
Burada açıklanan protokol geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme heterotipik hücre ko-kültür zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonlarının üretmek için kullanıldığı bir basit, in vitro prosedür adapte edilebilir (Şekil 1). Belirgin bir şekilde, örnek arası çeşitli iletişim modu araştırılması için uygundur. kritik adımlar üst tarafında ikinci bir hücre popülasyonu tohumlama,% 50 FBS ile takviye edilmiş ortam içinde parçanın alt tarafında, ilk hücre…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
For Cell Culture | |||
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Immunofluorescent Microscopy | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Flow Cytometric Analysis | |||
Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Western Blot Analysis | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |