We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
הבנת יחסי גומלין heterotypic מוקדם בין תאים סרטניים ואת stroma שאינו סרטני שמסביב חשובה הבהיר את האירועים שהובילו הפעלת סטרומה והקמת microenvironment הגידול (TME). כמה במבחנה במודלים vivo של TME פותחו; עם זאת, באופן כללי מודלים אלה אינם מאפשרים בידוד בקלות של אוכלוסיות תאים בודדות, בתנאים שאינם מביך, למחקר נוסף. כדי לעקוף את הקושי הזה, יש לנו עבד מודל TME במבחנה באמצעות מצע צמיחת תאים מורכבים להכניס קרום microporous חדיר המאפשר דור פשוט של אוכלוסיות תאים מועשרות גדל באופן אינטימי, עדיין בנפרד, משני צדי הממברנה של הכנס על שיתוף המורחבת פעמים -culture. באמצעות שימוש במודל זה, אנו מסוגלים לייצר פיברובלסטים סרטן קשור מועשרים מאוד (CAF) אוכלוסיות פיברובלסטים אדם דיפלואידי נורמלים הבאותשיתוף תרבות (120 שעות) עם תאי סרטן שד אנושיים גרורתי מאוד, ללא שימוש תיוג ניאון ו / או מיון התא. בנוסף, על ידי הוויסות הנקבובית בגודל של הכנס, אנחנו יכולים לשלוט על המצב של תקשורת בין תאית (למשל, תקשורת צומת-פער, גורמים מופרשים) בין שתי אוכלוסיות תאי heterotypic, המתיר חקירת המנגנונים העומדים בבסיס הפיתוח של TME, כולל התפקיד של חדירות צומת-הפער. מודל זה משמש כלי רב ערך לשיפור הבנתנו את האירועים הראשוניים שהובילו ייזום הסרטן-stroma, תחילת האבולוציה של TME, ואת אפקט הכיוונון של stroma על התגובות של תאים סרטניים לסוכנים טיפוליים.
במיקרו-סביבה של הגידול (TME) הוא מערכת מורכבת מאוד מורכבת תאי קרצינומה כי להתקיים ולהתפתח לצד stroma המארח. רכיב סטרומה זה בדרך כלל מורכב פיברובלסטים, myofibroblasts, לתאי אנדותל, רכיבי חיסון שונים, כמו גם תאי מטריקס 1. מרכיב משמעותי, לעתים קרובות רוב stroma זה, הם פיברובלסטים מופעלים, מכונים לעתים קרובות כמו פיברובלסטים סרטן קשור או פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (CAF) 2,3. בניגוד נורמלי, פיברובלסטים שאינם מופעל, cafs לתרום התחלה של גידול, התקדמות, אנגיוגנזה, פלישה, גרורות, והישנות 4-11 במגוון רחב של גידולים סרטניים, כולל סרטן שד, ערמונית, ריאות, לבלב, עור, מעי גס, ושט, השחלה 5,6,12-17. עם זאת, על טבעם המדויק של תרומת cafs ברחבי בפתוגנזה הסרטן נשאר מוגדר היטב. יתר על כן, עדות קלינית הוכיחה ערך פרוגנוסטי של cafs, התאמת נוכחותם ממאירות בדרגה גבוהה, כישלון הטיפול, 10,18,19 פרוגנוזה גרועה הכוללת.
ברור, שיפור הבנתנו את האירועים ליזום בפיתוח CAF, כמו גם התקשורת בין התאית בתיווך תפקידם בתוך TME, עשוי לספק מטרות טיפוליות חדשות ומלהיבות ואסטרטגיות משופרות שיכולים לשפר את תוצאות מטופל. כדי להשיג מטרה זו, כמה in vivo ו במודלים חוץ גופית פותחו. בעוד גישות in vivo הן מהורהרות יותר של 'TME החולה, יש להם מגבלות, כולל את המורכבות העצומות ואת ההטרוגניות הן בתוך ובין גידולים. יתר על כן, דגימות גידולים מ בבני אדם לעתים קרובות מאוד מייצגות שפותחו TME ואינן מאפשרות הבנה של האירועים ליזום TME. מחקרים בבעלי חיים ניסוייים מציעים כמה יתרונות, אולם הכללה של נתונים בעלי חיים לבני אדם צריך להיעשות בזהירות בשל הבדלי physiology בין בני אדם ובעלי חיים כמו מכרסמים (למשל, כימיה תיאול 20, קצב חילוף החומרים 21, סובלנות להדגיש 22, וכו '). יתר על כן, בניגוד לאוכלוסיה האנושית, שהיא גנטית הטרוגנית בטבע, בחיות מעבדה בדרך כלל הם התרבו הומוגניות. כמו כן, הוא לעתים קרובות קשה לבחון וריאציות פיסיולוגיות חולפות ושינויי התא פנוטיפ, כמו גם לשלוט על פרמטרים ספציפיים ניסוי באמצעות בעלי חיים כמו מכרסמים. לפיכך, במבחנה 2 ו 3 ממדים (2D and 3D) מודלים בתרבית רקמה מנוצלים לעתים קרובות כדי לקדם את ההבנה הבסיסית של פיתוח TME. למרות חוסר של תיאור מדויק של המורכבות של מערכות in vivo, מודלים אלה מציעים יתרונות המאפשרים חקירות מכניסטית מאוד. חוץ גופית מודלים לאפשר פשוטה יותר, ממוקד, יעיל וחסכוני ניתוח TME, לפיה מובהקות סטטיסטית ניתן להפיק נתוניםתאים ללא וריאציות מערכתיות המתעוררות אצל בעלי חיים.
ישנם כמה סוגים של מערכות במבחנה. שני הנפוץ ביותר TME במבחנה מודלים מורכבים בשכבה מעורבת או בתרביות תאים אליפטית. שתי השיטות התרבות הם יתרון לימודי יסוד של אינטראקציות בין תאית (למשל, תאים נורמליים עם תאים סרטניים) ו לניתוח שינויים פנוטיפ תאים שונים TME ספציפיים (למשל, הופעתה של פיברובלסטים סרטן הקשורים מן fibroblasts נורמלי). בנוסף, spheroids מסוגל ליצור מבנה מרקמה דמוית מהורהר יותר של TME, והוא יכול להיות נציג של ההטרוגניות גידול 23. עם זאת spheroids לעתים קרובות לייצר הדרגתי מתח חמצן מגוון הרחב של נפחים פני שכבות, אשר עלול לסבך מסקנות ניסוי 24. למרבה הצער, שני הדגמים מוגבלים מאוד ביכולתם לבודדת אוכלוסיות תאים טהורות עבור אפיון נוסף והלימוד הבא שיתוףתַרְבּוּת. לשם כך ידרוש לפחות סוג תא אחד להיות fluorescently-tagged או מתויג עם יצרנית זיהוי, ולאחר מכן חשיפת המעורבות ושיתוף תרבות מיון עיבוד התא נרחב להפריד בין אוכלוסיות תאים. בעוד סדרן תא הוא מסוגל לבודד אוכלוסיית תא טהורה למדי, אחד חייב להיות מודע של מתח הסלולר זיהום מיקרוביאלי פוטנציאל סיכוני 25.
כדי להקל על ההבנה של תקשורת בין תאית, מאמצים רבים הוקדשו לקראת פיתוח ואופטימיזציה במערכות חוץ גופית כי מקרוב לחקות את הסביבה vivo, תוך התרת גישה פשוטה. כלי אחד כזה הוא להכניס microporous חדיר, מצע קרום אשר פותחה הראשון בשנת 1953 26 ובהמשך מותאם ליישומים ומחקרים מגוונים (למשל, הקוטביות בתא 27, אנדוציטוזה 28, תחבורה התרופה 29, דוגמנות רקמת 30, FERTilization 31, עובר אורח אפקט 32,33, וכו '). מערכת זו מאפשרת את הצמיחה של תאים עם אנטומיים in vivo-כמו והבחנה פונקציונלית, כמו גם ביטוי של רבי in vivo סמני 34,35 שאינם נצפו כאשר בתרבית על plasticware בלתי חדיר. יתר על כן, הקרום הנקבובי מאוד דק (10 מיקרומטר העבה) מתיר דיפוזיה מהירה של מולקולות ושעות איזון, המדמה את סביבת vivo ומאפשרת תפקוד הסלולר עצמאי בשני תחומי תא apical ו basolateral. יתרון נוסף של השירות של הכנס כמערכת TME הוא ההפרדה הפיסית של שתי אוכלוסיות תאי heterotypic גדלו משני צדי הממברנה באותם תנאים סביבתיים, תוך שמירה על מצבים שונים של תקשורת בין תאית הדרך הנקבובית הממברנה. למרות מופרדים פיסיים, שתי אוכלוסיות התאים הם מצמידים מטבולית באמצעות אלמנטים המופרשים על ידם, כמו דהscribed כאן, גם בערוצים-junctional הפער. בנוסף, על ידי שמירה על ההכנסות ב in vivo מתח חמצן חלקי (PO 2), המודל מפחית את הסיבוכים של הדרגתיים חמצן כימיים שנצפו מערכות אחרות. במקום זאת, היא מגדילה את ההבנה של מנגנונים טבעיים שליטה על TME. יש לציין, כי שתי אוכלוסיות התאים יכולות להיות מבודדות בקלות עם טוהר גבוה, ללא תיוג ניאון ו / או מיון התא הבא פרקי שיתוף התרבות.
כאן אנו מתארים פרוטוקול במבחנת TME מורכב תאים אנושיים שד קרצינומה ו fibroblasts האנושי גדל, בהתאמה, משני הצדים להכניס קרום microporous חדיר, אבל עדיין בתקשורת מתמדת דו-כיוונית הדרך הנקבובית הממברנה. אנו מראים כי באמצעות ממברנות עם גדלים נקבוביים שונים, תרומת סוג מסוים של תקשורת בין תאית (למשל, גורמים המופרשים לעומת צומת פער) לפיתוחיכול להיחקר של TME.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, להתאמה בהליך במבחנה (איור 1) אשר מנצל להכניס קרום microporous חדיר ליצור אוכלוסיות תאים בודדות מועשר מתוך שיתוף תרבות של תאי heterotypic. באופן משמעותי, המודל מתאים חוקרת מצבים שונים של תקשורת בין תאית. השלבים הקריטיים כוללים בחירת הכ…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
For Cell Culture | |||
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Immunofluorescent Microscopy | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Flow Cytometric Analysis | |||
Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Western Blot Analysis | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |