We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
La comprensión de las interacciones tempranas heterotípicos entre las células cancerosas y el estroma no canceroso que rodea es importante en el esclarecimiento de los acontecimientos que conducen a la activación del estroma y el establecimiento del microambiente tumoral (TME). Varios in vitro y en modelos in vivo de la TME se han desarrollado; Sin embargo, en general, estos modelos no permiten fácilmente el aislamiento de poblaciones de células individuales, en condiciones no perturbar, para su posterior estudio. Para evitar esta dificultad, se ha empleado un modelo TME in vitro usando un sustrato de crecimiento de las células que consta de un inserto de membrana microporosa permeable que permite la generación sencilla de poblaciones de células altamente enriquecido crecido íntimamente, sin embargo, por separado, a cada lado de la membrana de la pieza de inserción para co extendida -Cultura veces. Mediante el uso de este modelo, que somos capaces de generar fibroblastos enormemente enriquecido asociada al cáncer (CAF) las poblaciones de fibroblastos humanos diploides normales siguienteco-cultivo (120 horas) con células de carcinoma de mama humano altamente metastásicas, sin el uso de marcado fluorescente y / o la clasificación de células. Además, mediante la modulación del tamaño de poro de la inserción, se puede controlar para el modo de comunicación intercelular (por ejemplo, comunicación brecha cruce, factores secretados) entre las dos poblaciones de células heterotípicos, que permite la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la TME, incluyendo el papel de la permeabilidad brecha de la salida. Este modelo sirve como una herramienta valiosa en la mejora de la comprensión de los eventos iniciales que conducen a la iniciación del cáncer de estroma, la evolución temprana de la TME, y el efecto de modulación del estroma en las respuestas de las células cancerosas a los agentes terapéuticos.
El microambiente tumoral (TME) es un sistema altamente complejo compuesto de células de carcinoma que coexisten y evolucionar junto estroma huésped. Este componente estromal típicamente consiste en fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, varios componentes inmunológicos, así como una matriz extracelular 1. Un constituyente importante, a menudo la mayoría de este estroma, son fibroblastos activados, refiere con frecuencia como fibroblastos asociados al cáncer o fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) 2,3. A diferencia de los fibroblastos normales, no activado, CAF contribuyen a la iniciación del tumor, la progresión, la angiogénesis, invasión, metástasis y la recurrencia 4-11 en una amplia variedad de carcinomas, incluyendo cáncer de mama, próstata, pulmón, páncreas, piel, colon, esófago, y ovario 5,6,12-17. Sin embargo, la naturaleza exacta de la contribución de CAF en toda la patogénesis del cáncer sigue siendo mal definidos. Por otra parte, la evidencia clínica ha demostrado un valor pronóstico de la CAF, Correlacionando su presencia a los tumores malignos de alto grado, los fracasos terapéuticos, y pobres en general 10,18,19 pronóstico.
Claramente, la mejora de nuestra comprensión de los sucesos iniciadores en el desarrollo de la CAF, así como las comunicaciones intercelulares que median su papel dentro de la TME, puede proporcionar emocionantes nuevas dianas terapéuticas y estrategias mejoradas que podrían mejorar los resultados del paciente. Hacia este objetivo, varios en vivo y en modelos in vitro han sido desarrollados. Si bien los métodos in vivo son más un reflejo de TME de los pacientes, poseen limitaciones, incluyendo la inmensa complejidad y heterogeneidad tanto dentro como entre los tumores. Por otra parte, las muestras tumorales procedentes de sujetos humanos a menudo representan muy desarrollados TME y no permiten una comprensión de los sucesos iniciadores TME. los estudios en animales experimentales ofrecen algunas ventajas, sin embargo, la generalización de los datos en animales a los seres humanos debe hacerse con precaución debido a las diferencias en physiology entre humanos y animales tales como roedores (por ejemplo, la química de tiol 20, la tasa metabólica 21, tolerancia al estrés 22, etc.). Además, a diferencia de la población humana, que es genéticamente heterogénea en la naturaleza, los animales de laboratorio son típicamente criados para la homogeneidad. Además, a menudo es difícil de examinar variaciones fisiológicas transitorios y los cambios del fenotipo de células, así como para el control de los parámetros experimentales específicos utilizando animales tales como roedores. Por lo tanto, 2- in vitro y modelos de cultivo de tejidos de 3 dimensiones (2D y 3D) son frecuentemente utilizados para avanzar en el conocimiento básico del desarrollo de TME. A pesar de su falta de una representación exacta de la complejidad de los sistemas in vivo, estos modelos ofrecen ventajas que facilitan en gran medida las investigaciones mecanicistas. Modelos in vitro permiten un análisis más simplificado, enfocado, y rentable de la TME, por lo que estadísticamente significativa los datos pueden ser generados encélulas libres de variaciones sistémicas que surgen en los animales.
Hay varias variedades de sistemas in vitro. Los dos modelos TME in vitro utilizados más comúnmente consisten en monocapa mixta o cultivos celulares esferoides. Ambos métodos de cultivo son ventajosas para estudios básicos de interacciones intercelulares (por ejemplo, células normales con células tumorales) y para el análisis de varios cambios de fenotipo celular específicos TME (por ejemplo, la aparición de los fibroblastos asociados con el cáncer de fibroblastos normales). Además, los esferoides son capaces de crear una estructura similar a un tejido más reflexiva del TME, y pueden ser representativos de la heterogeneidad del tumor 23. Sin embargo esferoides menudo producen muy diversos gradientes de tensión de oxígeno a través de capas, que pueden complicar conclusiones experimentales 24. Desafortunadamente, ambos modelos son extremadamente limitados en su capacidad para aislar poblaciones de células puras para su posterior caracterización y estudio siguiente co-cultura. Para ello, sería necesario al menos un tipo de célula que ser marcado con fluorescencia-o etiquetados con un fabricante de identificación, y luego someter el co-cultivo mixto a la extensa procesamiento y clasificación de células para separar las poblaciones de células. Mientras que un clasificador de células es capaz de aislar una población de células en lugar puro, uno debe ser consciente de estrés celular y la contaminación microbiana riesgos potenciales 25.
Para facilitar la comprensión de la comunicación intercelular, grandes esfuerzos se han dedicado a desarrollar y optimizar en sistemas in vitro que imitan estrechamente el entorno in vivo, al tiempo que permite un enfoque simplificado. Una de estas herramientas es la inserción microporosa permeable, un sustrato de membrana que fue desarrollado por primera vez en 1953 26 y posteriormente adaptado para diversas aplicaciones y estudios (por ejemplo, la polaridad celular 27, 28 endocitosis, transporte de drogas 29, el modelado de tejido 30, FERTilization 31, efecto espectador 32,33, etc.). Este sistema permite el crecimiento de las células con anatómica in vivo -como y la diferenciación funcional, así como la expresión de muchos en vivo marcadores 34,35 que no se observó cuando se cultivan en recipientes de plástico impermeable. Además, la membrana porosa extremadamente delgada (10 micras de espesor) permite la rápida difusión de las moléculas y los tiempos de equilibrio, que simula el entorno in vivo y permite el funcionamiento celular independiente en los dominios de células apical y basolateral. Una ventaja adicional de la utilidad de la inserción como un sistema de TME es su separación física de dos poblaciones de células cultivadas heterotípicos a cada lado de la membrana en las mismas condiciones ambientales, mientras que el mantenimiento de los diversos modos de comunicación intercelular a través de los poros de la membrana. Aunque físicamente separados, las dos poblaciones de células se acoplan metabólicamente a través de elementos secretadas y, como dedescribe aquí, también a través de los canales de gap-unión. Además, mediante el mantenimiento de las piezas de inserción en la tensión de oxígeno in vivo parcial (PO 2), el modelo reduce las complicaciones de oxígeno y químicas gradientes observados en otros sistemas. Más bien, se aumenta la comprensión de los mecanismos naturales que controlan el TME. En particular, las dos poblaciones de células pueden ser fácilmente aislados con alta pureza, sin el etiquetado fluorescente y / o la clasificación de células después de períodos prolongados de co-cultivo.
Aquí se describe un protocolo TME in vitro que consiste en células de carcinoma de mama humano y fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, a ambos lados de un inserto de membrana microporosa permeable, pero todavía en continua comunicación bidireccional a través de los poros de la membrana. Se demuestra que mediante el uso de membranas con diferentes tamaños de poro, la contribución de un tipo específico de la comunicación intercelular (por ejemplo, factores secretados frente a uniones gap) para el desarrollode la TME pueden ser investigados.
El protocolo descrito aquí es un simple, adaptable en procedimiento in vitro (Figura 1) que utiliza un inserto de membrana microporosa permeable para generar poblaciones de células individuales altamente enriquecido de un co-cultivo de células heterotípicos. De manera significativa, el modelo es adecuado para la investigación de diversos medios de comunicación intercelular. Los pasos críticos incluyen la selección de la pieza de inserción de tamaño de poro apropiado para el i…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
For Cell Culture | |||
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Immunofluorescent Microscopy | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Flow Cytometric Analysis | |||
Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Western Blot Analysis | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |