We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
فهم التفاعلات غيروي مبكرة بين الخلايا السرطانية والمحيطة سدى غير سرطانية المهم في توضيح الأحداث التي أدت إلى تفعيل انسجة وإنشاء المكروية الورم (TME). عدة في التجارب المختبرية والنماذج الحية من TME تم تطويرها. ومع ذلك، في عام هذه النماذج لا تسمح بسهولة عزل السكان الخلية الفردية، في ظل ظروف غير تكدير، لمزيد من الدراسة. للتحايل على هذه الصعوبة، ونحن قد استخدمت في المختبر نموذج TME باستخدام الركيزة نمو الخلايا تتكون من نفاذية إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها تسمح الجيل بسيط من السكان الخلية التخصيب نمت بشكل وثيق، ولكن بشكل منفصل، على جانبي غشاء إدراج لتعاون موسع مرات ğ ثقافة. من خلال استخدام هذا النموذج، ونحن قادرون على توليد المخصب إلى حد كبير الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) السكان من العادية الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا يليشارك في ثقافة (120 ساعة) مع خلايا سرطان الثدي النقيلي الإنسان إلى حد كبير، من دون استخدام العلامات الفلورية و / أو فرز الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، عن طريق تحوير حجم المسام من إدراج، يمكننا السيطرة على الوضع من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، الاتصالات تقاطع الفجوة، والعوامل يفرز) بين اثنين من السكان الخلية مغاير، الذي يسمح التحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور TME، بما في ذلك دور نفاذية الفجوة تقاطع. ويقدم النموذج بوصفه أداة قيمة في تعزيز فهمنا للأحداث الأولية مما أدى إلى بدء السرطان سدى، وتطور في وقت مبكر من TME، وتأثير تحوير للسدى على استجابات الخلايا السرطانية الى العوامل العلاجية.
المكروية الورم (TME) هو نظام معقد للغاية يتكون من خلايا سرطان أن تتعايش وتتطور جنبا إلى جنب مع سدى المضيف. يتكون هذا المكون انسجة عادة من الخلايا الليفية، myofibroblasts، والخلايا البطانية، ومختلف مكونات جهاز المناعة، وكذلك المصفوفة خارج الخلية 1. والمكونة كبير، في كثير من الأحيان أن غالبية هذه سدى، والخلايا الليفية تفعيلها، وكثيرا ما يشار إلى الخلايا الليفية المرتبطة السرطان أو الخلايا الليفية المرتبطة سرطان (CAF) 2،3. على عكس الخلايا الليفية الطبيعي، وعدم تفعيلها، تساهم مقاهي لبدء الورم، التقدم، الأوعية الدموية، والغزو، ورم خبيث، وتكرار 4-11 في مجموعة واسعة من السرطانات بما فيها سرطان الصدر والبروستاتا والرئة والبنكرياس والجلد والقولون والمريء، و المبيض 5،6،12-17. ومع ذلك، فإن الطبيعة الدقيقة للمساهمة مقاهي في جميع أنحاء المرضية السرطان لا تزال محددة بشكل واضح. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت الأدلة السريرية قيمة النذير من مقاهي، ربط وجودهم إلى الأورام الخبيثة عالية الجودة، وفشل العلاج، وعموما الفقراء 10،18،19 التكهن.
بوضوح، وتعزيز فهمنا للأحداث الشروع في التنمية CAF، فضلا عن الاتصالات بين الخلايا الوساطة دورها داخل TME، قد توفر أهداف علاجية جديدة مثيرة والاستراتيجيات المحسنة التي يمكن أن تحسن نتائج المرضى. وتحقيقا لهذا الهدف، وقد وضعت عدة في الجسم الحي ونماذج في المختبر. في حين النهج في الجسم الحي هي أكثر تعبيرا من TME المرضى، لديهم قيود، بما في ذلك التعقيد وعدم التجانس داخل وبين الأورام على حد سواء. وعلاوة على ذلك، وعينات من الورم من المواضيع الإنسان في كثير من الأحيان تمثل درجة عالية من التطور TME، ولا تسمح فهم TME بدء الأحداث. دراسات على حيوانات التجارب توفر بعض المزايا، لكن تعميم البيانات المأخوذة من الحيوانات إلى البشر وينبغي أن يتم بحذر وذلك بسبب الاختلافات في physiology بين البشر والحيوانات مثل القوارض (على سبيل المثال، الكيمياء ثيول 20، معدل الأيض 21، وتحمل الإجهاد 22، الخ). وعلاوة على ذلك، على عكس البشر، والتي هي غير متجانسة وراثيا في الطبيعة، وعادة ما تكون ولدت حيوانات المختبر إلى التجانس. أيضا، غالبا ما يكون من الصعب دراسة التغيرات الفسيولوجية عابرة وتغيرات الخلية النمط الظاهري، وكذلك للسيطرة على المعلمات التجريبية محددة باستخدام الحيوانات مثل القوارض. وهكذا، في المختبر 2- و 3 الأبعاد (2D و 3D) نماذج زراعة الأنسجة كثيرا ما تستخدم لتعزيز فهم أساسي للتنمية TME. وعلى الرغم من عدم وجود صورة دقيقة لتعقيد النظم في الجسم الحي، وهذه النماذج تقدم المزايا التي تسهل كثيرا التحقيقات الميكانيكية. في المختبر نماذج تسمح لتحليل أكثر بساطة، وركزت، وفعالة من حيث التكلفة TME، حيث دلالة إحصائية البيانات التي يمكن أن تتولد فيخلايا خالية من الاختلافات المنهجية التي تنشأ في الحيوانات.
وهناك عدة أنواع من النظم في المختبر. تتكون الأكثر شيوعا TME في المختبر النموذجين من أحادي الطبقة المختلطة أو مزارع الخلايا كروي. كلتا الطريقتين الثقافة هي مفيدة للدراسات الأساسية من التفاعلات بين الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا الطبيعية مع الخلايا السرطانية) ولتحليل مختلف التغيرات خلية النمط الظاهري محددة TME (على سبيل المثال، ظهور الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان من الخلايا الليفية الطبيعية). بالإضافة إلى ذلك، الكروية هي قادرة على خلق بنية تشبه النسيج أكثر تعبيرا عن TME، ويمكن أن تكون ممثلة للورم التجانس 23. ومع ذلك الكروية غالبا ما تنتج متفاوتة على نطاق واسع التدرجات توتر الأوكسجين عبر طبقات، والتي قد تعقد النتائج التجريبية 24. للأسف، وكلا النموذجين محدودا للغاية في قدرتها على عزل السكان الخلية نقية لمزيد من التوصيف والدراسة التالية المشاركثقافة. للقيام بذلك يتطلب نوع خلية واحدة على الأقل ليكون الموسومة fluorescently أو المسمى مع صانع تحديد، ومن ثم إخضاع مختلطة ثقافة مشتركة لمعالجة واسعة وخلية الفرز لفصل السكان الخلية. في حين أن فارز الخلية قادر على عزل السكان خلية النقي بدلا من ذلك، يجب على المرء أن يكون مدركا للإجهاد الخلوي والتلوث الميكروبي محتمل يهدد 25.
لتسهيل فهم الاتصالات بين الخلايا، تم بذل جهود كبيرة من أجل تطوير وتحسين نظم المختبر التي تحاكي بشكل وثيق البيئة في الجسم الحي، في حين يسمح نهج مبسطة. واحدة من هذه الأداة هو إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها قابلة للاختراق، وهو الركيزة الغشاء الذي تم تطويره لأول مرة في عام 1953 26 و في وقت لاحق تكييفها لتطبيقات متنوعة والدراسات (على سبيل المثال، الخلية القطبية 27، الإلتقام 28، نقل المخدرات 29، والنمذجة الأنسجة 30، فيرilization 31، وتأثير المارة 32،33، وما إلى ذلك). يسمح هذا النظام للنمو الخلايا في الجسم الحي مع تشبه التشريحية والتمايز الوظيفي، وكذلك التعبير الكثيرين في الجسم الحي علامات 34،35 التي لم يتم مراعاتها عند تربيتها على بلستيكور بردة. وعلاوة على ذلك، فإن غشاء مسامي رقيقة للغاية (10 ميكرون سميكة) يسمح الانتشار السريع للجزيئات والأوقات موازنة، والتي تحاكي البيئة في الجسم الحي ويسمح سير الخلوية مستقل في كل المجالات خلية قمية وbasolateral. ميزة إضافية لفائدة إدراج باعتباره نظام TME هو الفصل المادي اثنين من سكان الخلية مغاير نمت على جانبي الغشاء في نفس الظروف البيئية، مع الحفاظ على مختلف وسائل الاتصال بين الخلايا من خلال المسام الغشاء. على الرغم من فصل جسديا، تقترن السكان اثنين من خلية عملية الأيض عن طريق عناصر يفرز و، كما ديمكتوب هنا، أيضا من خلال قنوات الفجوة صلي. بالإضافة إلى ذلك، من خلال الحفاظ على إدراج في الجسم الحي في توتر الأوكسجين الجزئي (ص 2)، ونموذج يقلل من المضاعفات من الأوكسجين والمواد الكيميائية التدرجات التي لوحظت في الأنظمة الأخرى. بدلا من ذلك، لأنه يزيد من فهم آليات الطبيعية السيطرة على TME. والجدير بالذكر أن السكان الخلية اثنين يمكن عزلها مع نقاء عالية، من دون وضع علامات الفلورسنت و / أو فرز الخلايا بعد فترات طويلة من الثقافة المشتركة.
نحن هنا وصف في المختبر بروتوكول TME تتكون من خلايا سرطان الثدي البشرية والخلايا الليفية الإنسان نمت، على التوالي، على جانبي نفاذية غشاء إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها، ولكن حتى الآن في استمرار الاتصالات ثنائية الاتجاه من خلال مسام الغشاء. وتبين لنا أن باستخدام الأغشية مع أحجام المسام المختلفة، ومساهمة من نوع معين من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، العوامل يفرز مقابل تقاطعات الفجوة) في تطويرمن TME يمكن التحقيق فيها.
بروتوكول الموصوفة هنا هي بسيطة، قابلة للتكيف في إجراء المختبر (الشكل 1) التي تستخدم منفذ الصغيرة التي يسهل اختراقها إدراج غشاء لتوليد التخصيب السكان الخلية الفردية من شارك في ثقافة من خلايا غيروي. إلى حد كبير، وهذا النموذج هو مناسبة للتحقيق في مختل…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
For Cell Culture | |||
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Immunofluorescent Microscopy | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Flow Cytometric Analysis | |||
Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Western Blot Analysis | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |