We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
La comprensione delle prime interazioni eterotipica tra le cellule tumorali e lo stroma non cancerose circostante è importante per chiarire gli eventi che portano all'attivazione stromale e l'istituzione del microambiente tumorale (TME). Diversi in vitro e in vivo della TME sono stati sviluppati; Tuttavia, in generale, questi modelli non facilmente consentono l'isolamento di singole popolazioni cellulari, in condizioni non perturbante, per ulteriori studi. Per aggirare questa difficoltà, abbiamo impiegato un modello TME in vitro utilizzando un substrato di crescita cellulare costituito da un inserto membrana microporosa permeabile che permette semplice generazione di popolazioni cellulari altamente arricchito cresciuto intimamente e separatamente, su entrambi i lati della membrana di inserto per co estesa volte -Culture. Attraverso l'uso di questo modello, siamo in grado di generare notevolmente arricchito fibroblasti cancro-associata (CAF) popolazioni da fibroblasti umani normali diploidi seguenteco-coltura (120 hr) con cellule di carcinoma mammario umano altamente metastatico, senza l'uso di codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule. Inoltre, modulando la dimensione dei pori dell'inserto, possiamo controllare il mezzo di comunicazione intercellulare (ad esempio, comunicazione gap-junction, fattori secreti) tra le due popolazioni cellulari eterotipica, che consente studio dei meccanismi alla base dello sviluppo del TME, compreso il ruolo della permeabilità gap-junction. Questo modello serve come un valido strumento per migliorare la nostra comprensione degli eventi iniziali che portano al cancro iniziazione-stroma, la prima evoluzione della TME, e l'effetto modulante dello stroma sulle risposte delle cellule tumorali di agenti terapeutici.
Il microambiente tumorale (TME) è un sistema altamente complesso costituito da cellule di carcinoma che coesistono e si evolvono insieme stroma ospite. Questo componente stromale consiste tipicamente di fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, i vari componenti del sistema immunitario, così come una matrice extracellulare 1. Un costituente significativo, spesso la maggior parte di questo stroma, sono fibroblasti attivati, spesso indicato come fibroblasti cancro-associata o fibroblasti carcinoma-associato (CAF) 2,3. A differenza dei normali fibroblasti non attivati, CAF contribuiscono iniziazione tumorale, progressione, angiogenesi, invasione, metastasi e recidive 4-11 in un'ampia varietà di carcinomi, compresi seno, prostata, polmone, pancreas, pelle, colon, esofago, e dell'ovaio 5,6,12-17. Tuttavia, l'esatta natura del contributo della CAF in tutta patogenesi del cancro rimane scarsamente definita. Inoltre, l'evidenza clinica ha dimostrato un valore prognostico della CAF, Correlando la loro presenza a tumori di alto grado, fallimento della terapia, e la scarsa 10,18,19 generale la prognosi.
Chiaramente, migliorando la nostra comprensione degli eventi che iniziano nello sviluppo CAF, così come le comunicazioni intercellulari che mediano il loro ruolo all'interno della TME, può fornire nuove interessanti bersagli terapeutici e strategie avanzate che potrebbero migliorare i risultati del paziente. A tale scopo, diversi in vivo e in vitro sono stati sviluppati. Mentre gli approcci in vivo sono più riflessivo di TME dei pazienti, che possiedono limitazioni, tra cui l'immensa complessità ed eterogeneità sia all'interno che tra i tumori. Inoltre, campioni di tumore da soggetti umani spesso rappresentano molto sviluppati TME e non consentono una comprensione degli eventi che iniziano TME. studi su animali sperimentali offrono alcuni vantaggi, tuttavia generalizzazione dei dati sugli animali agli esseri umani dovrebbe essere fatto con cautela a causa delle differenze nei Physiology tra esseri umani e animali come roditori (ad esempio, la chimica tiolo 20, il tasso metabolico 21, la tolleranza allo stress 22, etc.). Inoltre, a differenza della popolazione umana, che è geneticamente eterogenea in natura, gli animali da laboratorio sono in genere allevati per omogeneità. Inoltre, è spesso difficile esaminare variazioni fisiologiche transitorie e cambiamenti fenotipo delle cellule, nonché per il controllo dei parametri sperimentali specifici utilizzando animali come roditori. Così, in vitro 2 e 3 dimensioni (2D e 3D) modelli di coltura dei tessuti sono spesso utilizzati per far progredire la comprensione di base dello sviluppo TME. Nonostante la loro mancanza di una rappresentazione accurata della complessità dei sistemi in vivo, questi modelli offrono vantaggi che facilitano notevolmente indagini meccanicistici. In vitro modelli consentono un'analisi più semplificata, concentrato e conveniente di TME, per cui statisticamente significativa i dati possono essere generati incellule gratuitamente da variazioni sistemici che sorgono in animali.
Ci sono diverse varietà di sistemi in vitro. I due modelli TME in vitro più comunemente utilizzati sono costituiti da monostrato misto o colture cellulari sferoidali. Entrambi i metodi di coltura sono vantaggiose per studi di base di interazioni intercellulari (ad esempio, le cellule normali con cellule tumorali) e per l'analisi di varie modifiche fenotipo cellulare specifici TME (ad esempio, emergere di fibroblasti cancro-associata di fibroblasti normali). Inoltre, gli sferoidi possono creare una struttura di tessuto simile più riflessivo della TME, e possono essere rappresentativi del tumore eterogeneità 23. Tuttavia sferoidi spesso producono molto diversi gradienti di tensione di ossigeno attraverso i livelli, che possono complicare le conclusioni sperimentali 24. Purtroppo, entrambi i modelli sono estremamente limitati nella loro capacità di isolare le popolazioni di cellule pure per un'ulteriore caratterizzazione e lo studio dopo cooperazionecultura. Per fare questo è necessario almeno un tipo di cellula di essere fluorescente-tag o etichettati con un produttore di identificazione, e quindi sottoponendo il misto di co-coltura di svariati processi di lavorazione e di smistamento delle cellule per separare le popolazioni di cellule. Mentre un cell sorter è in grado di isolare una popolazione di cellule piuttosto pura, si deve essere consapevoli di stress cellulare e potenziale contaminazione microbica rischi 25.
Per facilitare la comprensione della comunicazione intercellulare, grandi sforzi sono stati dedicati allo sviluppo e all'ottimizzazione sistemi in vitro che imitano da vicino l'ambiente in vivo, pur consentendo un approccio semplificato. Uno di questi strumenti è l'inserto microporosa permeabile, un substrato di membrana che è stata sviluppata nel 1953 26 e successivamente adattato per diverse applicazioni e gli studi (per esempio, la polarità delle cellule 27, endocitosi 28, il trasporto di droga 29, la modellazione del tessuto 30, FertSterilizza- 31, effetto astante 32,33, etc.). Questo sistema permette la crescita delle cellule in vivo con -come anatomica e differenziazione funzionale, nonché espressione di molti in vivo marcatori 34,35 che non si osserva quando coltivate su plasticware impermeabile. Inoltre, l'estremamente sottile membrana porosa (10 micron di spessore) consente la rapida diffusione delle molecole e tempi di equilibrazione, che simula l'ambiente in vivo e permette funzionamento cellulare indipendente in entrambi i domini di cellule apicali e basolaterale. Un ulteriore vantaggio di utilità dell'inserto come sistema TME è la separazione fisica dei due popolazioni cellulari eterotipica coltivati su entrambi i lati della membrana nelle stesse condizioni ambientali, mantenendo diverse modalità di comunicazione intercellulare attraverso i pori della membrana. Anche se fisicamente separati, le due popolazioni cellulari sono metabolicamente accoppiati tramite elementi secreti e, come dedescritto qui, anche attraverso i canali gap-giunzionale. Inoltre, mantenendo gli inserti a in vivo tensione parziale dell'ossigeno (PO 2), il modello riduce le complicazioni di ossigeno e chimiche gradienti osservati in altri sistemi. Piuttosto, aumenta la comprensione dei meccanismi naturali che controllano il TME. In particolare, le due popolazioni cellulari possono essere facilmente isolati con elevata purezza, senza codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule dopo periodi prolungati di co-coltura.
Qui si descrive un protocollo in vitro TME costituito da cellule di carcinoma mammario umano e fibroblasti umani coltivati rispettivamente, ai due lati di un inserto membrana microporosa permeabile, ma ancora in continua comunicazione bidirezionale attraverso i pori della membrana. Abbiamo dimostrato che utilizzando membrane con differenti dimensioni dei pori, il contributo di un tipo specifico di comunicazione intercellulare (per esempio, fattori secreti contro giunzioni) allo sviluppodella TME può essere indagato.
Il protocollo qui descritto è un semplice, adattabile a procedura vitro (Figura 1) che utilizza un inserto membrana microporosa permeabile per generare altamente arricchito popolazioni di cellule individuali di una co-coltura di cellule eterotipica. Significativamente, il modello è adatto per studiare vari modi di comunicazione intercellulare. Le fasi critiche comprendono selezionando l'inserto pori di dimensioni appropriate per specifiche interesse sperimentale (s), seminando la…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
For Cell Culture | |||
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Immunofluorescent Microscopy | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Flow Cytometric Analysis | |||
Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Western Blot Analysis | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |