Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei é um parasita protozoário que causa trypanosomasis Africano humana e nagana em bovinos. T. brucei é um organismo ideal para a análise da função da proteína, devido à combinação de um genoma de alta qualidade, numerosos conjuntos de dados e proteómica transcriptômica e ferramentas moleculares bem desenvolvidos 1-3. Avanços na proteômica e sequenciamento resultaram em grandes conjuntos de dados que destacam potencialmente genes interessantes 4-6; no entanto, muitos genes têm o mínimo de informação que lhes estão associados nas bases de dados existentes. Existe portanto uma necessidade de um método de alto rendimento para ajudar a caracterização funcional de proteínas.
A expressão de uma proteína com a etiqueta pode dar uma multiplicidade de perspectivas sobre a função de uma proteína. Por exemplo, uma proteína etiquetada com um epitopo ou a proteína fluorescente pode estar localizada por microscopia de fluorescência, que dá informações sobre o onde ProtEin pode ser exercer o seu efeito biológico. Alternativamente, uma proteína marcado com um TAP 7, 8 ou HaloTag Sua marca pode ser purificado para ensaios bioquímicos e identificação dos seus parceiros de interação.
Recentemente, desenvolveu uma metodologia de marcação robusta para T. brucei 9. Este utilizado longo de iniciadores de PCR para gerar o ADN para transfecção e deixada a marcação de dezenas de proteínas em paralelo – uma grande melhoria com os protocolos existentes. Temos agora melhorou a escalabilidade deste protocolo em formas pró-cíclicos por uma ordem de magnitude. Aqui, apresentamos o nosso método em que realizar a PCR e transfecção em placas de 96 poços, com a recuperação e seleção ocorrendo em placas de 24 poços. Enquanto centenas de proteínas podem agora ser marcado em paralelo este método fornece um método rentável e viável para marcar o genoma inteiro tripanossoma.
melhorias dramáticas na sensibilidade da proteômica e métodos transcriptômica nos últimos 5-10 anos forneceu dados valiosos em milhares de genes e seus produtos. No entanto, as ferramentas para lidar com a função destas proteínas não mantiveram o ritmo.
Marcação de uma proteína facilita numerosos experimentos para determinar a sua função. Por exemplo, uma proteína podem ser fundidos com uma proteína fluorescente em uma variedade de cores diferentes para facilitar estudos de localização e de co-localização. Etiquetas desenvolvido para microscopia eletrônica, tais como APEX2 ou miniSOG 11,12, permitir a localização ultra-estrutural da proteína marcada. Marcações de bioquímica, tais como a etiqueta TAP, e ProtC-TEV-Prota (PTP) etiquetar 7,13 permitir a purificação de complexos associados com a proteína para a identificação de parceiros de ligação ou em ensaios bioquímicos in vitro.
Os passos específicos que são críticos para o sucesso da PROTOCol são: a incorporação de DMSO para a PCR master mix 1, congelação da PCR master mix 1 antes da adição da Mistura Principal 2, a utilização da polimerase comercial na Master Mix 2 e a modificação do tampão cytomix electroporação. Em nossa experiência, é necessário utilizar o dobro do número de células para C transfections terminal de marcação como for N transfections terminal de marcação, a fim de alcançar uma proporção semelhante de poços positivos. Portanto, todos os passos devem ser realizados tal como descrito.
Esta técnica só é susceptível de ser bem sucedida quando a transfecção o inseto pró-cíclica forma tripanossoma. Formas corrente sanguínea tem uma menor eficiência de transfecção 14, além disso eles são propensos a morrer durante a selecção devido a toxicidade dependente de densidade que não está relacionada com a droga seletiva. Portanto, o nosso protocolo anterior representa a melhor tecnologia atual para marcar de forma sanguínea tripanossomas 9. É também provável que o transeficiência de infecção variará dependendo do isolado tripanossoma específica. Este protocolo foi otimizado usando 927 SMOX as formas procíclica – outras estirpes pode exigir otimização adicional. As medidas que podem aumentar a probabilidade de sucesso incluem: o aumento da quantidade do fragmento amplificado por PCR, o aumento do número de células incluídas na transfecção.
Apresenta-se um método em que centenas de proteínas pode ser marcado em paralelo. Isso irá facilitar estudos de larga escala sobre a localização e interação, complementando conjuntos de dados grandes existentes e fornecendo informações valiosas para a comunidade. modelos de primers estão disponíveis mediante solicitação e uma lista de modelos de plasmídeos está disponível em: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |