Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
트리파노소마 (Trypanosoma) brucei는 가축에서 인간의 아프리카 trypanosomasis 및 nagana을 일으키는 원생 동물 기생충이다. T. brucei 인해 고품질 게놈 수많은 프로테오믹스 및 transcriptomics 데이터 세트와 잘 개발 툴 1-3 분자의 결합으로 단백질 기능 분석을위한 이상적인 유기체이다. 단백질 체학 및 시퀀싱의 발전은 잠재적으로 흥미있는 유전자 4-6 강조 대규모 데이터 세트 이어질; 그러나, 많은 유전자는 기존의 데이터베이스와 연관된 최소한의 정보를 가지고있다. 단백질의 기능적 특성을 돕기 위해 고 처리량 방법이 요구된다.
태그가 단백질의 발현은 단백질의 기능에 대한 통찰력의 다양성을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 단백질 또는 에피토프 태그 단백질은 PROT에 대한 정보를 제공 형광 현미경에 의해 국부적 수EIN은 생물학적 효과를 발휘 될 수 있습니다. 대안 적으로, TAP 7 태그 단백질은 HaloTag 8 또는 그의 태그 생화학 분석법과의 상호 작용 파트너의 식별을 위해 정제 될 수있다.
우리는 최근 T.에 대한 강력한 태그 방법론을 개발 brucei 9. 이 형질의 DNA를 생성하기 위해 긴 프라이머 PCR을 사용하여 병렬 단백질의 수십개의 태그 허용 – 기존 프로토콜에 대한 주요 개선. 우리는 지금 크기의 순서에 의해 procyclic 형태의이 프로토콜의 확장 성을 개선했다. 여기서, 우리는 24 웰 플레이트에서 발생 회수 및 선택과 함께 96 웰 플레이트에 PCR 및 형질 전환을 수행하는 우리의 방법을 제시한다. 단백질 수백 이제 병렬로 태그 될 수있는 바와 같이,이 방법은 전체 게놈 트리파노소마 태그를위한 비용 효율적이고 실현 가능한 방법을 제공한다.
지난 5-10년에서 단백질 체학 및 transcriptomics 방법의 감도에 극적인 개선은 유전자와 그들의 제품의 수천에 중요한 데이터를 제공하고 있습니다. 그러나 도구는이 단백질의 기능이 속도를 유지하지 않은 해결합니다.
단백질에 태그를 지정하면 그 기능을 결정하기 위해 다양한 실험을 용이하게한다. 예를 들어, 단백질은 지역화 공동 지역화 연구를 용이하게하기 위해 서로 다른 색상의 다양한 형광 단백질에 융합 될 수있다. 태그는 APEX2 또는 miniSOG 11, 12 등의 전자 현미경을 위해 개발 된 태그 단백질의 미세 현지화 할 수 있습니다. 같은 TAP 태그 및 ProtC-TEV-의 동지 (PTP) 등의 생화학에 대한 태그, 7,13 바인딩 파트너의 식별 또는 생체 외 생화학 적 분석에서 단백질과 관련된 단지의 정화를 허용 태그.
protoc의 성공에 중요한 특정 단계상기 PCR 마스터 믹스 (1)에 DMSO 혼입 마스터 믹스 (2), 마스터 믹스 (2)의 상업용 폴리머의 사용과 cytomix 전기 천공 버퍼의 변형 예의 첨가하기 전에 PCR 마스터 믹스 한 동결 : 올이다. 우리의 경험에서, 양성의 웰과 유사한 비율을 달성하기 위해 N 말단 태깅 형질 감염 용으로 C 말단 태깅을 위해 형질 세포의 두 수를 사용하는 것이 필요하다. 따라서 설명한 모든 단계가 수행되어야한다.
이 기술은 곤충 procyclic 양식 트리파노소마를 형질 때 성공에만 가능성이있다. 혈류 형태는 또한 그들이 때문에 선택적 약물 관련이 농도 의존적 독성 선택시 사망 할 가능성이 낮은 형질 전환 효율 (14)이있다. 따라서, 우리의 이전 프로토콜은 혈류 형태의 트리 파노 솜 (9)의 태그의 현재 최고의 기술을 나타낸다. 또한 트랜스 것으로 보인다fection 효율은 특정 트리파노소마의 분리에 의존 달라질 수 있습니다. 다른 균주 추가 최적화를 요구할 수있다 -이 프로토콜은 927 SMOX procyclic 양식을 사용하여 최적화 하였다. 성공 확률을 증가시킬 조치 포함, PCR 증폭 물 양을 증가 형질 감염에 포함되는 세포의 수를 증가시킨다.
우리는 단백질의 수백 병렬로 태그 할 수있는 방법을 제시한다. 이는 기존의 대규모 데이터 세트를 보완하고 지역 사회에 귀중한 정보를 제공, 현지화 및 상호 작용에 대규모 연구를 촉진 할 것이다. 프라이머 템플릿 요청 및 플라스미드 템플릿 목록에 따라 사용할 수 있습니다에서 사용할 수 http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |