Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei è un protozoo parassita che causa trypanosomasis africana umana e nagana nei bovini. T. brucei è un organismo ideale per l'analisi della funzione proteica grazie alla combinazione di un genoma di alta qualità, numerose proteomica e trascrittomica set di dati e strumenti molecolari ben sviluppati 1-3. I progressi nella proteomica e il sequenziamento hanno portato a grandi serie di dati che evidenziano potenzialmente geni interessanti 4-6; Tuttavia, molti geni hanno informazioni minime ad essi associati nei database esistenti. Vi è quindi la necessità di un metodo di alta produttività per aiutare caratterizzazione funzionale della proteina.
Espressione di una proteina marcata può dare una molteplicità di intuizioni in funzione di una proteina. Ad esempio, una proteina marcata con una proteina fluorescente o epitopo può essere localizzato mediante microscopia a fluorescenza, che fornisce informazioni su dove protein potrebbe essere esercitando il suo effetto biologico. In alternativa, una proteina contrassegnati con un TAP 7, 8 o HaloTag sua etichetta può essere purificato per saggi biochimici e l'identificazione dei suoi partner di interazione.
Recentemente abbiamo sviluppato una metodologia di codifica robusta per T. brucei 9. Questo era lungo Primer PCR per generare il DNA per trasfezione e ha permesso la marcatura di decine di proteine in parallelo – un miglioramento importante di protocolli esistenti. Ora abbiamo migliorato la scalabilità di questo protocollo in forme prociclico da un ordine di grandezza. Qui, vi presentiamo il nostro metodo in cui eseguiamo la PCR e trasfezione in piastre a 96 pozzetti, con il recupero e la selezione che si verificano in piastre da 24 pozzetti. Come centinaia di proteine possono essere contrassegnati in parallelo questo metodo fornisce un metodo conveniente e fattibile per la codifica l'intero genoma trypanosome.
notevoli miglioramenti nella sensibilità di proteomica e trascrittomica metodi negli ultimi 5-10 anni ha fornito dati preziosi su migliaia di geni e dei loro prodotti. Tuttavia, gli strumenti per affrontare la funzione di queste proteine non hanno tenuto il passo.
Tagging una proteina facilita numerosi esperimenti per determinare la sua funzione. Ad esempio, una proteina può essere fuso ad una proteina fluorescente in una varietà di colori diversi per facilitare gli studi di localizzazione e co-localizzazione. Tag sviluppato per la microscopia elettronica, come ad esempio APEX2 o miniSOG 11,12, consentire la localizzazione ultrastrutturale della proteina codificata. Parole chiave per la biochimica, come ad esempio il tag TAP, e ProtC-TEV-Prota (PTP) Indicatore 7,13 permettere la purificazione di complessi associati con la proteina per l'identificazione di partner di legame o in saggi biochimici in vitro.
I passi specifici che sono cruciali per il successo del ProtoColo sono: l'incorporazione di DMSO nella PCR Master Mix 1, congelamento della PCR Master Mix 1 prima dell'aggiunta del Master Mix 2, l'uso della polimerasi commerciale in Master Mix 2 e la modifica del buffer cytomix elettroporazione. Nella nostra esperienza, è necessario utilizzare il doppio del numero di celle per C trasfezioni terminale di codifica da per N trasfezioni terminale di codifica per ottenere una percentuale simile di pozzetti positivi. Pertanto, tutti i passaggi devono essere eseguiti come descritto.
Questa tecnica è solo probabile che sia successo quando transfecting l'insetto prociclico modulo trypanosome. Forme sangue hanno una bassa efficienza di trasfezione 14, inoltre sono probabilità di morire durante la selezione a causa della tossicità densità-dipendente che non è correlato al farmaco selettivo. Pertanto, il nostro precedente protocollo rappresenta la migliore tecnologia attuale per la codifica di tripanosomi forma sangue 9. E 'anche probabile che il transefficienza perfezione varia dipende dalla specifica isolato trypanosome. Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando 927 SMOX forme prociclico – altri ceppi possono richiedere ulteriore ottimizzazione. Le misure che possono aumentare la probabilità di successo includono: aumentando la quantità di PCR amplicone, aumentando il numero di cellule inclusi nella trasfezione.
Vi presentiamo un metodo in cui centinaia di proteine possono essere contrassegnati in parallelo. Ciò faciliterà studi su larga scala sulla localizzazione e l'interazione, integrando grandi set di dati esistenti e di fornire informazioni preziose per la comunità. modelli Primer sono disponibili su richiesta e un elenco di plasmidi modelli sono disponibili presso: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |