Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei הוא טפיל protozoan שגורמת trypanosomasis אדם אפריקאי nagana בבקר. ט brucei הוא אורגניזם אידיאלי לניתוח תפקוד חלבון עקב השילוב של הגנום באיכות גבוהה, פרוטאומיקה רב מערכי נתוני transcriptomics וכלים מולקולריים מפותחים 1-3. התקדמות פרוטאומיקה וסדר גרמה מערכי נתונים גדולים המדגישים גנים מעניינים פוטנציאל 4-6; יש עם זאת, גנים רבים מידע מינימאלי הקשורים בהם במסדי הנתונים הקיימים. לכן יש צורך שיטת תפוקה גבוהה כדי לסייע ואפיון חלבונים פונקציונלי.
ביטוי של חלבון מתויג יכול לתת ריבוי תובנה הפונקציה של חלבון. לדוגמה, חלבון מסומן בחלבון או epitope ניאון יכול להיות מקומי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר נותן מידע על המקום ממנו protעין עלולה להיות הפעלת ההשפעה הביולוגית שלה. לחלופין, חלבון מתויג עם ברז 7, HaloTag 8 או התג שלו יכול להיות מטוהר עבור מבחני ביוכימיים ואיתור שותפי האינטראקציה שלה.
אנחנו לאחרונה פתחנו מתודולוגיה תיוג חזקה ט brucei 9. זה זמן רב בשימוש פריימר PCR על מנת ליצור את ה- DNA עבור transfection ואפשר התיוג של עשרות חלבונים במקביל – שיפור משמעותי כדי פרוטוקולים קיימים. עכשיו שיפרנו את יכולת ההרחבה של פרוטוקול זה בצורות procyclic ידי סדר גודל. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו שבו אנחנו מבצעים את PCR ו transfection לתוך צלחות 96-היטב, עם ההתאוששות והבחירה המתרחשים 24 גם צלחות. צירופם של מאות חלבונים יכול עכשיו להיות מתויג במקביל שיטה זו מספקת חסכונית ריאלי שיטה תיוג הגנום trypanosome כולו.
שיפור דרמטי את הרגישות של חקר החלבונים ושיטות transcriptomics ב 5-10 השנים האחרונות סיפקה נתונים חשובים על אלפי גנים ומוצריהם. עם זאת, את הכלים כדי להתמודד עם תפקודם של חלבונים אלה לא עמדו בקצב.
תיוג חלבון הופך לפשוט ניסויים רבים כדי לקבוע את תפקידו. לדוגמא, חלבון יכול להיות התמזג חלבון פלואורסצנטי במגוון צבעים שונים כדי להקל על מחקרי לוקליזציה שיתוף לוקליזציה. תגיות שפותחו עבור במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון APEX2 או miniSOG 11,12, לאפשר לוקליזציה ultrastructural של החלבון המתויג. תגיות עבור ביוכימיה, כגון תג TAP, ו ProtC-TEV-ProtA (PTP) לתייג 7,13 לאפשר טיהור של מתחמים הקשורים החלבון לזיהוי שותפים מחייבים או מבחני ביוכימיים במבחנה.
הצעדים הספציפיים הם קריטיים להצלחת protocol הוא: השילוב של DMSO לתערובת 1 מאסטר PCR, מקפיא של מיקס מאסטר PCR 1 לפני התוספת של מיקס מאסטר 2, השימוש פולימראז המסחרי מיקס מאסטר 2 ואת השינוי של חיץ electroporation cytomix. מניסיוננו, יש צורך להשתמש כפול ממספר תאים עבור transfections תיוג מסוף C ובאשר transfections תיוג מסוף N על מנת להשיג שיעור דומה של בארות חיוביות. לכן, כל הצעדים צריכים להתבצע כפי שתוארו.
טכניקה זו עשויה היחידה להצליח כאשר transfecting trypanosome טופס procyclic חרקים. יש צורות דם יעילה transfection נמוך 14, יתר על כן הם צפויים למות במהלך בחירה בשל רעילויות צפיפות תלויה כי אינה קשורה לתרופה סלקטיבית. לכן, הפרוטוקול הקודם שלנו מייצג את הטכנולוגיה הטובה ביותר הנוכחית עבור תיוג של trypanosomes טופס דם 9. כמו כן סביר להניח כי טרנסיעילות fection תשתנה תלוי לבודד trypanosome הספציפי. פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות 927 SMOX צורות procyclic – זנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. צעדים שעשויים להגביר את סיכויי הצלחת כוללים: הגדלת הסכום של amplicon PCR, הגדלת מספר התאים הכלולים transfection.
אנו מציגים שיטה שבה מאה חלבונים יכולים להיות מתויגות במקביל. זה יקל מחקרים בקנה מידה גדול על לוקליזציה ואינטראקציה, המשלימה מערכי נתונים גדולים קיימים ומתן מידע שלא יסולא בפז לקהילה. תבניות פריימר יימסרו לכל מבקש ורשימת תבניות פלסמידים זמין מ: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |