Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der bei Rindern menschlichen afrikanischen trypanosomasis und Nagana verursacht. T. brucei ist ein idealer Organismus für die Analyse von Proteinfunktion aufgrund der Kombination von hoher Qualität Genoms, zahlreiche Proteomik und Transkriptomik Datensätze und gut entwickelte molekulare Werkzeuge 1-3. Die Fortschritte in der Proteomik und Sequenzierung haben in großen Datensätzen geführt , die potentiell interessante Gene 4-6 hervorzuheben; Allerdings haben viele Gene minimale Informationen mit ihnen in den vorhandenen Datenbanken verbunden. Es besteht daher ein Bedarf für ein Hochdurchsatzverfahren Protein funktionelle Charakterisierung zu unterstützen.
Expression eines markierten Proteins kann eine Vielzahl von Einsichten in ein Protein der Funktion geben. Zum Beispiel ist ein Protein mit einem fluoreszierenden Protein oder epitopmarkiert kann durch Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert werden, die Informationen darüber, wo die prot gibtein könnte seine biologische Wirkung werden ausübt. Alternativ kann ein Protein mit einer TAP getaggt 7, HaloTag 8 oder His – Tag kann für biochemische Assays und Identifizierung seiner Interaktionspartner , gereinigt werden.
Wir entwickelten kürzlich eine robuste Tagging Methodik für T. brucei 9. Benutzten langen Primer PCR die DNA für die Transfektion zu erzeugen und das Tagging von Dutzenden von Proteinen in parallel erlaubt – eine wesentliche Verbesserung bestehender Protokolle. Wir haben nun die Skalierbarkeit dieses Protokolls in prozyklischen Formen durch eine Größenordnung verbessert. Hier stellen wir unsere Methode, wo wir die PCR und Transfektion in 96-Well-Platten durchzuführen, wobei die Rückgewinnung und Auswahl auftretenden in Platten mit 24 Vertiefungen. Wie Hunderte von Proteinen können nun parallel markiert bietet dieses Verfahren eine kostengünstige und praktikable Methode für die gesamte Trypanosomen Genom-Tagging.
Dramatische Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Proteomik und Transkriptomik Methoden in den letzten 5-10 Jahren auf Tausenden von Genen und ihren Produkten wertvolle Daten zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die Werkzeuge die Funktion dieser Proteine Adresse haben nicht Schritt gehalten.
Tagging ein Protein erleichtert zahlreiche Versuche, seine Funktion zu bestimmen. Zum Beispiel kann ein Protein in einer Vielzahl von verschiedenen Farben zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden Studien Lokalisation und Co-Lokalisierung zu erleichtern. Stichworte für die Elektronenmikroskopie entwickelt, wie APEX2 oder miniSOG 11,12 erlauben ultrastrukturelle Lokalisierung des markierten Proteins. Tags für die Biochemie, wie dem TAP – Tag und ProtC-TEV-ProtA (PTP) -Tag 7,13 Reinigung von Komplexen ermöglichen , mit dem Protein zur Identifizierung von Bindungspartnern oder in vitro biochemische Assays verbunden.
Die spezifischen Schritte, die für den Erfolg der Protoc kritischol, sind: der Einbau von DMSO in die PCR Master Mix 1, Gefrieren des PCR Master Mix 1 vor der Zugabe des Master Mix 2, die Verwendung des handelsüblichen Polymerase in Master Mix 2 und der Modifikation des cytomix Elektroporationspuffer. Nach unserer Erfahrung ist es notwendig, die doppelte Anzahl von Zellen für die C-terminalen Markierungs Transfektionen wie für N-Terminal-Tagging Transfektionen verwendet werden, um einen ähnlichen Anteil an positiven Vertiefungen zu erreichen. Daher sollten alle Schritte wie beschrieben durchgeführt.
Diese Technik ist wahrscheinlich nur erfolgreich sein, wenn das Insekt prozyklischen Form Trypanosomen transfizieren. Blutstrom Formen haben eine geringere Transfektionseffizienz 14, zudem sind sie wahrscheinlich aufgrund von Dichteabhängigen Toxizität bei der Auswahl zu sterben, die mit dem selektiven Medikament nicht in Beziehung steht. Daher stellt unsere bisherigen Protokoll die aktuelle beste Technologie für 9 von Blutformen Trypanosomen – Tagging. Es ist auch wahrscheinlich, dass die transfection Effizienz hängt von der spezifischen Trypanosomen-Isolat variieren. Dieses Protokoll wurde mit 927 SMOX prozyklischen Formen optimiert – andere Stämme zusätzliche Optimierung erfordern. Maßnahmen, welche die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen können, umfassen: die Menge des PCR-Amplikons, Erhöhung der Anzahl von Zellen in der Transfektionseffizienz eingeschlossen.
Wir stellen eine Methode, in der Hunderte von Proteinen können parallel markiert werden. Dies wird, groß angelegte Studien über die Lokalisierung und Interaktion zu erleichtern, die Ergänzung bestehender großer Datensätze und wertvolle Informationen für die Allgemeinheit erbringen. Primer-Vorlagen sind auf Anfrage erhältlich und eine Liste von Plasmiden Vorlagen finden Sie unter: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |