Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Bir transkripsiyon faktörü olarak Foxp3 ifade eden düzenleyici T (T reg) hücreleri, CD4 + T hücrelerinin alt kümeleridir. T reg hücreleri bağışıklık yanıtını düzenleyerek immün tolerans ve homeostasis bakım çok önemli rol oynarlar. Regülatör T hücrelerinin temel görevi efektör T (T EFF) hücrelerinin çoğalması ve IFN-y, TNF-a ve IL-2 gibi sitokinlerin üretimini baskılamaktır. T eff hücrelerin fonksiyonunu inhibe regülatör T hücrelerinin yeteneği inatçı bir patojen enfeksiyon ve kanser gelişimi sırasında gelişmiş olduğu gösterilmiştir. Dinlenme veya iltihaplı koşullar altında regülatör T hücrelerin fonksiyonunu fare ya da insan regülatör T hücreleri kullanılarak in vitro bastırma edilen çeşitli testler öne sürülmüştür değerlendirmektir. Bu çalışmanın temel amacı, fenotip ve dinlenme arasındaki baskılayıcı fonksiyon farklılıkları ve aktive olmuş T reg karşılaştırmak için bir yöntem geliştirmektirHücreler. Aktive T reg hücreleri izole etmek için, fareler, lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) klon 13 (CL13) ile LCMV kronik zorlanma enfekte edildi. LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak izole regülatör T hücreleri naif farelerden izole edilen regülatör T hücreleri dinlenme ile karşılaştırıldığında aktive fenotip ve geliştirilmiş baskılayıcı aktivitesini sergiledi. Burada, T reg hücrelerini dinlenme aktive T reg hücreleri ayırt etmek ex vivo fenotip analizi için temel protokol açıklar. Ayrıca, tam olarak aktif regülatör T hücrelerin baskılayıcı aktivitesi ölçümü için bir protokol açıklar.
Düzenleyici T (T reg) hücreleri kendi gelişimi ve işlevi 1 için bir transkripsiyon faktörü olarak forkhead kutusu P3 (Foxp3) ifade eder. Buna ek olarak, regülatör T hücreleri, CD25 2, lenfosit aktivasyonu geni 3 (ara-3) 3, glukokortikoitin yol açtığı tümör nekroz faktörü reseptör 4, ve sitotoksik gibi çeşitli başka molekülleri ifade T-lenfosit-ilişkili protein 4 (CTLA-4) '5 yüzeylerinde ya da hücre içi bölgeye. Bu tür virüsler 6,7, bakteriler 8,9, ve parazitler 10-12 veya kanser gelişimi 13,14 sırasında olduğu gibi patojenlerin çeşitli kronik enfeksiyon sırasında, T reg hücreleri gelişmiş baskılayıcı fonksiyon gösteren, aktif hücrelerin içine ayırt hale hedefleme efektör CD4 + ve CD8 + T hücreleri. Kağıtların bir dizi genişletilmiş ve aktive regülatör T hücreleri, bozulmuş CD8 + T hücresi yanıt vermeyen katkıda sürmüşlerdirarkadaş retrovirüs (FV) enfeksiyonu 15-17 sırasında e. FV kaynaklı regülatör T hücrelerinin IFN-y ya da Granzim B ekspresyonu ve CD8 + T hücrelerinin 15-17 sitotoksik reaktivite inhibe eder. Ayrıca, bir herpes simpleks virüsü enfeksiyon modelinde, bu virüse spesifik CD8 + T hücreleri ve immünopatojenik CD4 + T hücrelerinin 18-20 infiltrasyonu ile ciddi doku hasarının genişleme sonuçlandı CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin tükenmesinin bildirilmiştir.
Lenfositik koryomenenjit virüsünün klon 13 suşu ile kronik olarak enfekte olan fareler (LCMV CL13) 21-24 yaygın kronik virüs enfeksiyonu esnasında efektör T hücrelerinin (EFF) ve regülatör T hücrelerinin fenotip ve işlevini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Kalıcı LCMV enfeksiyonunun sırasında virüs spesifik T EFF hücreleri kademeli olarak efektör fonksiyonunu kaybeder ve tükenmiş T (T exh) hücreler haline gelirler. Diğer yandan, TREG hücreleri virüs-belirgin T hücre tepkisine 25 önleme yeteneklerinden güçlendirir. T eff hücrelerinin çalışması kapasitesinde azalma, T eff hücreleri üzerinde inhibe edici reseptör artışı, antijen-sunan hücrelerin değişmiş fonksiyonu, bağışıklık sitokinlerin üretimi ve artan frekans veya regülatör T gelişmiş fonksiyonu olarak çeşitli faktörler tarafından açıklanabilir hücreler 26. T hücresi bastırılmasıyla ilgili faktörler arasında, programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) -expressing T exh hücreleri ve regülatör T hücreleri yaygın antijene kalıcılık ve baskılayıcı çevre işaretlerinden olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu T reg hücrelerinin PD-1 yolunun ve ablasyon abluka gelişmiş T hücre fonksiyonuna neden olduğunu bildirdi ve LCMV kronik enfeksiyon 27 sırasında viral yük azaltıldı. Ayrıca, regülatör T hücreleri LCMV 23,25 ile farelerin kronik enfeksiyon sırasında aktive edilir </syukarı> ve baskılayıcı fonksiyonu 25 güçlendirilmiştir. PD-1 yüksek regülatör T hücreleri hem de T exh hücre ifade edilir, ve PD-1 regülatör T hücreleri tarafından ifade seviyesi, T hücre proliferasyonunu 25 inhibe etme baskılayıcı fonksiyonu gücü ile ilişkilidir.
Burada, LCMV CL13 ve naif farelerden izole dinlenme T reg hücreleri ile enfekte edilen farelerin izole aktive T reg hücrelerinin özelliklerini karşılaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, aktive edilmiş T-hücrelerinin ayrılmasında reg ve ex vivo fenotipi incelenmesi, hem de in vitro olarak da bastırma etkinliğini ölçmek için bir dizi işlemden açıklar.
Regülatör T hücrelerinin sadece küçük bir bölümü, farelerde ve insanlarda mevcut olmakla beraber, bunların bir bağışıklık tepkisi düzenlenmesi ve immün tolerans korumada önemli bir rol oynar olarak işlev anlamak önemlidir. T numarası ve baskılayıcı işlevleri kronik virüs enfeksiyonuna 15-20 yanı sıra kanser ilerlemesi 13,14 sırasında hücreler artar reg. Bu muhtemelen devam antijen uyarılmasına bağlıdır. Reg hücreleri antijen seba…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |