Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
التنظيمية تي (T ريج) الخلايا، التي تعبر عن Foxp3 كعامل النسخ، هي مجموعات فرعية من خلايا CD4 + T. خلايا تي ريج تلعب أدوارا حاسمة في التسامح المناعة، وصيانة التوازن من خلال تنظيم الاستجابة المناعية. الدور الأساسي للخلايا ريج T هو قمع انتشار المستجيب تي (T EFF) الخلايا وإنتاج السيتوكينات مثل IFN-γ، TNF-α، و IL-2. وقد ثبت أن قدرة خلايا T ريج "لمنع وظيفة الخلايا ممثل المؤسسة تي تتعزز خلال العدوى الممرض استمرار وتطور مرض السرطان. لتوضيح وظيفة الخلايا ريج T تحت يستريح أو الملتهبة الظروف، ومجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر قمع باستخدام الماوس أو تي الخلايا البشرية ريج وقد وضعت. والهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة لمقارنة الاختلافات في النمط الظاهري وظيفة القمعية بين الراحة والمفعلين تي ريجالخلايا. لعزل تنشيط خلايا T ريج، والفئران المصابة مع الليمفاوي فيروس التهاب السحايا المشيمي (LCMV) استنساخ 13 (CL13)، سلالة مزمن في LCMV. خلايا تي ريج معزولة عن الطحال من الفئران المصابة CL13-LCMV أظهرت كل من النمط الظاهري تنشيط وتعزيز النشاط القمعية مقارنة مع يستريح خلايا ريج تي المعزولة من الفئران ساذجة. هنا، نحن تصف البروتوكول الأساسي للخارج الحي تحليل النمط الظاهري للتمييز تنشيط خلايا T ريج من يستريح خلايا تي ريج. وعلاوة على ذلك، نحن تصف بروتوكول لقياس النشاط القمعية من خلايا ريج T تشغيلها بالكامل.
التنظيمية خلايا تي (T ريج) تعبر عن P3 مربع forkhead (Foxp3) باعتباره عامل النسخ لتنميتها وظيفة 1. بالإضافة إلى ذلك، خلايا تي ريج تعبر عن مختلف الجزيئات الأخرى مثل CD25 2، اللمفاويات التنشيط الجيني 3 (LAG-3) 3، الناجم عن جلايكورتيكود عامل نخر الورم مستقبلات 4، والسامة للخلايا اللمفاوية التائية-بروتين يرتبط 4 (CTLA-4) 5 على سطحها أو منطقة داخل الخلايا. خلال العدوى المزمنة مع أنواع مختلفة من مسببات الأمراض مثل الفيروسات 6،7، 8،9 البكتيريا، والطفيليات 10-12، أو في سياق تطور مرض السرطان 13،14، تصبح خلايا T ريج متباينة في خلايا تفعيلها، تظهر تعزيز وظيفة القمعية خلايا تستهدف المستجيب CD4 + و CD8 + T. وقد اقترح عدد من الأوراق أن الخلايا ريج T توسيع وتنشيط تساهم في ضعف في رد و الخلايا CD8 + Tالبريد خلال صديق الارتجاعي (اناث) عدوى 15-17. الناجم FV-خلايا تي ريج تمنع IFN-γ أو التعبير باء granzyme للتفاعل السامة للخلايا من خلايا CD8 + T 15-17. وعلاوة على ذلك، في الهربس البسيط نموذج عدوى فيروس، أفيد أن استنفاد الخلايا ريج CD4 + CD25 + T أدى إلى توسيع الخلايا CD8 + T الفيروس محددة وتلف الأنسجة الشديد نتيجة لتسلل immunopathogenic خلايا CD4 + T 18-20.
الفئران المصابة بشكل مزمن مع سلالة استنساخ 13 من فيروس المشيمي اللمفاوي (LCMV CL13) 21-24 وقد استخدمت على نطاق واسع لوصف النمط الظاهري وظيفة الخلايا التائية المستجيب (T EFF) والخلايا ريج T خلال عدوى فيروس المزمن. خلال العدوى LCMV المستمر، الفيروس محددة الخلايا التائية ممثل المؤسسة يفقد تدريجيا وظيفة المستجيب وأصبحت منهكة خلايا تي (T EXH). من ناحية أخرى، Tخلايا ريج تعزز قدرتها على قمع الفيروس محددة تي استجابة الخلية 25. انخفاض في قدرة فاعلة من الخلايا ممثل المؤسسة T يمكن تفسيرها من خلال عدة عوامل مثل upregulation من المستقبلات المثبطة على خلايا ممثل المؤسسة T، وظيفة تغيير الخلايا العارضة للمستضد، وإنتاج السيتوكينات immunoregulatory، وزيادة تواتر أو تعزيز وظيفة تي ريج خلايا 26. ومن بين العوامل التي تدخل في تي قمع الخلايا، موت الخلية المبرمج البروتين 1 (PD-1) واعتبرت على نطاق واسع -expressing خلايا EXH تي وخلايا T ريج باعتبارها من أهم دعامات استمرار مستضد والبيئة القمعية. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الحصار المفروض على مسار PD-1 والاجتثاث من خلايا ريج T يؤدي إلى تعزيز وظيفة الخلايا التائية وانخفض الحمل الفيروسي خلال LCMV عدوى مزمنة 27. وعلاوة على ذلك، يتم تنشيط خلايا T ريج خلال العدوى المزمنة من الفئران مع LCMV 23،25 </sتصل> وتعزيز وظيفتها القمعية 25. وأعربت PD-1 كبير على خلايا T ريج وكذلك خلايا T EXH، ومستوى PD-1 أعرب من قبل خلايا ريج T يرتبط مع قوة من وظيفتها القمعية لمنع انتشار الخلايا التائية 25.
هنا، نحن تصف طريقة لمقارنة خصائص الخلايا ريج T تنشيط معزولة من الفئران المصابة مع LCMV CL13 ويستريح خلايا تي ريج معزولة من الفئران ساذجة. وعلاوة على ذلك، نفسر سلسلة من العمليات لفصل تنشيط خلايا T ريج ودراسة على النمط الظاهري خارج الحي، وكذلك قياس النشاط القمعية في المختبر.
على الرغم من مجرد عدد قليل من الخلايا ريج T موجودة في الفئران والبشر، فمن المهم أن نفهم وظيفة لأنها تلعب دورا حاسما في تنظيم الاستجابة المناعية والحفاظ على التسامح المناعي. عدد والقمعية وظائف تي ريج خلايا زيادات خلال عدوى فيروس المزمن 15-20 وكذلك سرطا?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |