Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Regolamentazione delle cellule T (T reg), che esprimono Foxp3 come un fattore di trascrizione, sono sottoinsiemi di cellule T CD4 +. Le cellule T reg svolgono un ruolo cruciale nella tolleranza immunitaria e manutenzione omeostasi dalla regolazione della risposta immunitaria. Il ruolo primario delle cellule T reg è di sopprimere la proliferazione delle cellule T effettrici (T eff) e la produzione di citochine, quali IFN-γ, TNF-α e IL-2. È stato dimostrato che la capacità delle cellule T reg di inibire la funzione delle cellule T eff è migliorata durante l'infezione patogeno persistente e lo sviluppo del cancro. Per chiarire la funzione delle cellule T reg in condizioni di riposo o infiammate, una varietà di saggi in vitro soppressione utilizzando cellule reg topo o T umana sono stati ideati. L'obiettivo principale di questo studio è quello di sviluppare un metodo per confrontare le differenze di fenotipo e la funzione soppressiva tra riposo e reg T attivatecellule. Per isolare le cellule T attivate reg, i topi sono stati infettati con il virus linfocitica choriomeningitis (LCMV) clone 13 (CL13), un ceppo cronica di LCMV. Le cellule T reg isolate dalla milza di topi LCMV CL13-infettati esposti sia il fenotipo attivato e l'attività soppressiva maggiore rispetto a riposo cellule T reg isolate da topi naive. Qui, descriviamo il protocollo di base per l'analisi ex vivo fenotipo di distinguere le cellule T attivate reg dal riposo cellule T reg. Inoltre, si descrive un protocollo per la misurazione dell'attività soppressiva di cellule T reg pienamente attivato.
T regolatorie (T reg) cellule esprimono scatola forkhead P3 (Foxp3) come un fattore di trascrizione per il loro sviluppo e la funzione 1. Inoltre, le cellule reg T esprimono varie altre molecole come CD25 2, gene linfociti-attivazione 3 (GAL-3) 3, indotta da glucocorticoidi tumor necrosis factor receptor 4, e linfociti T citotossici-proteina associata 4 (CTLA-4) 5 sulla loro superficie o regione intracellulare. Durante l'infezione cronica con vari tipi di agenti patogeni come virus, batteri 6,7 8,9 e parassiti 10-12, o in corso di sviluppo del cancro 13,14, le cellule T reg si differenziano in cellule attivate, visualizzando la funzione soppressiva migliorata cellule effettrici mira CD4 + e CD8 + T. Un certo numero di documenti hanno suggerito che le cellule T espanse reg e attivati contribuiscono ai deteriorate respons cellule CD8 + Te durante amico retrovirus (FV) l'infezione 15-17. Le cellule T reg FV-indotte inibiscono IFN-γ o l'espressione granzima B e reattività citotossica delle cellule T CD8 + 15-17. Inoltre, in un modello di infezione da virus herpes simplex, è stato riferito che la deplezione delle cellule reg T CD4 + CD25 + provocato l'espansione di cellule T CD8 + specifiche per virus e gravi danni ai tessuti da infiltrazione di cellule T CD4 + immunopatogenici 18-20.
Topi infettati cronicamente con il clone 13 ceppo di virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV CL13) 21-24 sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare il fenotipo e la funzione delle cellule T effettrici (T FEP) e le cellule T reg durante l'infezione cronica da virus. Durante l'infezione LCMV persistente, specifico per il virus T cellule eff perdono progressivamente la loro funzione effettrici e diventano esaurite le cellule T (T exh). D'altra parte, Tcellule reg rafforzano la loro capacità di sopprimere la risposta delle cellule specifiche del virus T 25. La diminuzione della capacità di funzionamento delle cellule eff T può essere spiegato da diversi fattori quali upregulation dei recettori inibitori su cellule eff T, alterata funzione delle cellule presentanti l'antigene, la produzione di citochine immunomodulanti, e aumento della frequenza o migliorata funzione di T reg cellule 26. Tra i fattori coinvolti nella soppressione delle cellule T, morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) esprimente cellule EXH T e le cellule T reg sono stati ampiamente considerati come i tratti distintivi di antigene persistenza e l'ambiente soppressivo. Recentemente, è stato riferito che il blocco della via PD-1 e l'ablazione delle cellule T reg portare ad una maggiore funzione delle cellule T e una diminuzione del carico virale durante LCMV infezione cronica 27. Inoltre, le cellule T reg vengono attivate durante l'infezione cronica di topi con LCMV 23,25 </sup> e la loro funzione soppressiva è rafforzata 25. PD-1 è altamente espresso sulle cellule T reg così come le cellule T EXH, e il livello di PD-1 espressa dalle cellule T reg correla con la forza della loro funzione soppressiva di inibire la proliferazione delle cellule T 25.
Qui, descriviamo un metodo per confrontare le caratteristiche delle cellule T attivate reg isolati da topi infettati con LCMV CL13 e le cellule reg riposo T isolate da topi naive. Inoltre, si spiega una serie di processi per separare le cellule T attivate reg ed esaminare la loro ex vivo fenotipo, nonché misurare la loro attività soppressiva in vitro.
Anche se solo un piccolo numero di cellule T reg esiste nei topi e nell'uomo, è importante capire la loro funzione come giocano un ruolo cruciale nella regolazione della risposta immunitaria e mantenimento della tolleranza immunitaria. Le funzioni di numeri e soppressive di T reg cellule aumenta nel corso di una infezione da virus cronica 15-20 così come la progressione del cancro 13,14. Questo è probabilmente dovuto alla stimolazione antigenica continua. Per valutare l…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |