Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Regulatoire T (T reg) cellen, die Foxp3 expressie als een transcriptiefactor, zijn subsets van CD4 + T-cellen. T reg cellen spelen een cruciale rol bij immuun tolerantie en homeostase onderhoud door het reguleren van de immuunrespons. De primaire rol van T reg cellen de proliferatie van effector T (T eff) cellen en de productie van cytokinen zoals IFN-γ, TNF-α en IL-2 te onderdrukken. Het is aangetoond dat het vermogen van T-cellen reg om de functie van T-cellen te remmen eff wordt versterkt bij persistente pathogeeninfectie en kankerontwikkeling. Om de functie van T-cellen reg grond rusten of ontstoken, kunnen er diverse in vitro onderdrukking assays met muis of humane T-cellen reg bedacht verduidelijken. Het belangrijkste doel van deze studie is om een methode om de verschillen in fenotype en onderdrukkende functie tussen rustende en geactiveerde T-reg te vergelijken ontwikkelencellen. Aan geactiveerde T-cellen reg isoleren, werden de muizen geïnfecteerd met lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV) kloon 13 (CL13), een chronische stam van LCMV. Reg T cellen geisoleerd uit de milt van LCMV CL13-geïnfecteerde muizen vertoonden zowel de geactiveerde fenotype en verbeterde onderdrukkende activiteit in vergelijking met rustende T cellen reg geïsoleerd uit naïeve muizen. Hier beschrijven we de basisprotocol voor ex vivo fenotype analyse geactiveerde T-cellen reg onderscheiden van rustende T-cellen reg. Verder beschrijven we een protocol voor het meten van de onderdrukkende activiteit van volledig geactiveerde T-cellen reg.
Regulatoire T (T reg) cellen brengen forkhead box P3 (Foxp3) als een transcriptiefactor voor hun ontwikkeling en werking 1. Bovendien T reg cellen brengen verschillende andere moleculen zoals CD25 2, lymfocyt-activering gen 3 (LAG-3) 3, glucocorticosteroïde tumor necrosis factor receptor 4 en cytotoxische-T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (CTLA-4) 5 op hun oppervlak of intracellulaire gebied. Tijdens chronische infectie met verschillende soorten ziekteverwekkers zoals virussen 6,7, 8,9 bacteriën en parasieten 10-12 of tijdens kankerontwikkeling 13,14, raken T reg cellen gedifferentieerd in geactiveerde cellen en vertoont verbeterde onderdrukkende functie targeting effector CD4 + en CD8 + T-cellen. Een aantal artikelen hebben gesuggereerd dat uitgebreid en geactiveerde T-cellen reg bijdragen tot verminderde CD8 + T cel response tijdens vriend retrovirus (FV) infectie 15-17. FV-geïnduceerde T reg cellen te remmen IFN-γ of granzyme B expressie en reactiviteit van cytotoxische CD8 + T-cellen 15-17. Bovendien, in een herpes simplex virus-model, werd gemeld dat depletie van CD4 + CD25 + T cellen reg resulteerde in het vergroten van virus-specifieke CD8 + T-cellen en ernstige weefselschade door infiltratie van immunopathogene CD4 + T-cellen 18-20.
Muizen chronisch geïnfecteerd met het kloon 13 stam van lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV CL13) 21-24 zijn op grote schaal gebruikt om het fenotype en de functie van effector T-cellen (T eff) en T cellen reg karakteriseren tijdens chronische virusinfectie. Tijdens aanhoudende LCMV infectie, virus-specifieke T eff cellen geleidelijk verliezen hun effector functie en uitgeput raken T (T EXH) cellen. Anderzijds, Treg cellen versterken hun vermogen om virus-specifieke T-cel respons 25 te onderdrukken. De afname van de werkcapaciteit van de T eff cellen kunnen worden verklaard door verschillende factoren zoals verhoogde expressie van remmende receptoren op T eff cellen veranderde functie van antigeenpresenterende cellen, productie van immunoregulerende cytokinen en verhoogde frequentie of verbeterde functie van T reg 26 cellen. Tussen de bij T-cel suppressie factoren, geprogrammeerde celdood eiwit-1 (PD-1) tot expressie brengen T exh-cellen en T-cellen reg zijn algemeen beschouwd als kenmerken antigeen persistentie en onderdrukkende omgeving. Recentelijk werd gemeld dat blokkade van de PD-1 pathway en verwijdering van T-cellen reg leiden tot verhoogde T cel functie en verminderde viral load bij LCMV chronische infectie 27. Bovendien worden T-cellen geactiveerd reg tijdens chronische infectie van muizen met LCMV 23,25 </sup> en hun onderdrukkende functie wordt versterkt 25. PD-1 wordt sterk tot expressie gebracht op T-cellen reg en exh T-cellen en het niveau van PD-1 door T reg cellen tot expressie correleert met de kracht van de onderdrukkende functie om T-celproliferatie 25 remmen.
We beschrijven een werkwijze om de eigenschappen van geactiveerde T-cellen reg geïsoleerd uit muizen geïnfecteerd met LCMV CL13 en rustende T cellen reg geïsoleerd uit naïeve muizen te vergelijken. Verder leggen wij een reeks processen om geactiveerde T-cellen reg scheiden en onderzoeken hun ex vivo fenotype, en meten hun onderdrukkende activiteit in vitro.
Hoewel slechts een klein aantal T-cellen reg bestaan in muizen en mensen, is het belangrijk om de functie te begrijpen omdat zij een cruciale rol bij het reguleren van de immuunrespons en immuun tolerantie spelen. Het aantal en de onderdrukkende functie van T-cellen reg stijgt tijdens een chronische virusinfectie 15-20 evenals de progressie van kanker 13,14. Dit komt waarschijnlijk door aanhoudend antigeen stimulatie. De T cellen reg functioneren onder a…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |