Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 REG) 세포, CD4 + T 세포의 서브 세트이다. T의 등록 세포는 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 등록 세포의 주요 역할은 효과기 T (T의 EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T 세포에 등록하는 기능, 마우스 또는 인간 T 등록 세포를 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T 레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T 세포는 등록 나이브 마우스로부터 단리 된 T 세포를 등록 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 등록 된 T 세포 휴식에서 활성화 된 T 세포를 등록 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 등록 세포의 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.
규제 T (T의 REG) 세포는 개발 및 기능 1 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 등록 세포는 CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) (3), 글루코 코르티코이드 – 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 (4) 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) (5) 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 6,7, 8,9 박테리아, 기생충 10-12 또는 암 13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 등록 셀은 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 +와 CD8 + T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 등록 세포가 손상된 CD8 + T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 15 ~ 17시 전자. FV 유발 T에 등록 셀은 IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 + T 세포의 세포 독성 15-17 반응성을 억제한다. 또한, 단순 포진 바이러스 감염 모델에서, 이는 바이러스 – 특이적인 CD8 + T 세포 및 immunopathogenic CD4 + T 세포를 18-20의 침윤 심각한 조직 손상의 확대 결과 CD4 + CD25 + T에 등록 세포의 고갈을보고 하였다.
림프 구성 맥락 수막염 바이러스의 복제 13 균주 만성적으로 감염된 마우스 (LCMV CL13) 21-24 널리 만성 바이러스 감염 동안 효과기 T 세포 (T의 EFF) 및 T의 등록 세포의 표현형 및 기능을 특성화하는데 사용되어왔다. 영구 LCMV 감염시 바이러스 관련 T EFF의 세포는 점차적으로 자신의 이펙터 기능을 잃고 지쳐 T (T의 배기) 세포가된다. 한편, T에서레지 세포는 바이러스 특이 적 T 세포 반응 (25)을 억제하는 능력을 강화한다. T 개의 EFF 셀의 작동 능력의 감소는 이러한 T EFF 세포 억제 성 수용체의 상향 조절, 항원 제시 세포의 변경 기능, 면역 조절 사이토 카인의 생산 및 증가 된 주파수 또는 T의 등록 향상된 기능 등 여러 가지 요인들에 의해 설명 될 수있다 세포 26. T 세포 억제에 관여하는 요소 중에서, 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1) 발현 T의 배기 세포와 T에 등록 세포 널리 항원 지속성 및 억제 환경의 특징으로 간주되어왔다. 최근에는 T의 등록 셀의 PD-1 경로의 폐색 및 제거를 향상 T 세포의 기능을 야기한다는보고 LCMV 만성 감염시 바이러스로드 (27)가 감소 하였다. 또한, T의 등록 세포는 LCMV (23, 25)와 쥐의 만성 감염시 활성화 </s업>과 억제 기능 (25)을 강화한다. PD-1은 높은 T에 등록 세포뿐 아니라 T의 배기 세포 발현되며, PD-1 T에 등록 세포에 의해 발현 수준은 T 세포의 증식 (25)을 억제하는 그들의 억제 기능의 강도와 상관 관계.
여기서는 LCMV CL13 및 나이브 마우스로부터 단리 휴지 T에 등록 세포 감염 쥐로부터 분리 활성화 T 등록 세포의 특성을 비교하는 방법을 설명한다. 더욱이, 우리는 활성화 된 T 세포의 레지 분리 및 표현형 생체 검사뿐만 아니라 시험 관내에서의 억제 활성을 측정하기위한 일련의 처리를 설명한다.
T 세포의 레지 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 13,14 세포 증가 REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. 레지 세포 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |