This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.
Здесь мы опишем протокол секвенирования РНК следующего поколения , которая позволяет De Novo узлов и внутри хоста вариантные вызовы вирусных геномов , собранных из клинических и биологических источников. Метод объективной и универсальной; он использует случайные праймеры для синтеза кДНК и не требует предварительных знаний о вирусного контента последовательности. До создания библиотеки, избирательное переваривания РНКазы Н на основе используется для истощить нежелательные РНК – в том числе поли (р.а.) и носитель рибосомной РНК – от вирусного образца РНК. Селективный истощение улучшает как качество данных и количество уникальных просмотров в вирусных РНК библиотек секвенирования. Кроме того, стадия а транспозазу на основе 'tagmentation' используется в протоколе, поскольку это сокращает общее время строительства библиотеки. Протокол позволил быстрое глубокое секвенирование более 600 вируса Ласса и Эбола образцы коллекций, в том числе с обеих крови и ткани изолирует-и широко применима к другим микробные геномики исследований.
Следующее поколение Секвенирование вирусов из клинических источников может сообщить передачу и эпидемиологии инфекций, а также помочь поддержать роман диагностики, вакцины и терапевтическое развитие. Синтез кДНК с использованием случайных праймеров позволило обнаружить и сборку геномов из расходящегося, сострахования инфицировании или даже новых вирусов 1,2. Как и с другими объективными методами, нежелательные примеси занимают много секвенирование чтения и негативно повлиять на результаты секвенирования. Хост и поли (РЗ) РНК-носитель являются примеси, присутствующие во многих существующих вирусных коллекций образцов.
Протокол описывает эффективный и экономичный способ глубоких вирусных геномов секвенирование РНК на основе объективной общей Секвенирование РНК. Метод использует РНКазы Н селективного истощения шаг 3 для удаления нежелательных рибосом хозяина и РНК – носитель. Селективный истощение обогащает для вирусного контента (рисунок 1) и улучшает общее качество данных секвенирования(Рисунок 2) из клинических образцов. Кроме того, tagmentation применяется к протоколу, поскольку это значительно сокращает сроки строительства библиотеки. Эти методы были использованы для быстрого генерирования больших наборов данных Эбола и Ласса геномов вируса 2,4,5 и может быть использована для изучения широкого спектра РНК -содержащих вирусов. И, наконец, этот подход не ограничивается образцов человека; Полезность селективного разрушения была продемонстрирована на образцах ткани , собранных из Ласса-инфицированных грызунов и приматов модели заболеваний , отличных от человека 5,6.
Рисунок 1. Общая РНК Содержание Отражает Обогащение Ласса вируса содержимого с помощью Selective Истощение. Запуск общего содержания (вход РНК) и обогащение уникальных вируса Ласса (LASV) читает (содержание библиотеки) при истощении рРНК из девяти различных клинических изолятов. Эта цифра была изменена с 6 <em>. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Высшее качество Секвенирование После того, как РНК Carrier Истощение. Срединные базовые качества на секвенирования цикла поли (РЗ) -contaminated вируса Ласса библиотеки (красный) и контроль (без носителя наблюдается в библиотеке, черный) из доклада QC 13. Как прочитать 1 и читать 2 парных концевых чтений объединяются в BAM файл библиотеки и оценки качества представлены на каждой базе. Эта цифра была изменена с 6. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Вирусная РНК-сл детали протокола строительство библиотек непосредственно из извлеченныйРНК собирали из клинических и биологических образцов. Для обеспечения личной безопасности, все вирусные сыворотки, плазмы и ткани образцы должны быть инактивируется в соответствующих буферов до экстракции РНК. В некоторых инактивация и извлечения комплектов, несущей поли (гА) РНК входит; это будет удалена во время начального этапа РНКазы Н селективного истощения. На основе полного выздоровления, ожидаемая концентрация РНК-носителя составляет 100 нг / мкл. В протоколе, 110 нг / мкл олиго дТ РНК (1.1x концентрация носителей) используется для истощения. Если поли (гА) носитель не присутствует в образце, то олиго (дТ) не должны быть добавлены до истощения.
Следующий протокол предназначен для 24 реакций в формате ПЦР пластины (до 250 мкл объем). Более ранняя версия этого протокола было сообщено в Matranga, и др. 6.
Изложенная подход позволяет надежный, универсальный, быстрое секвенирование и был использован для секвенирования вируса Эбола во время вспышки 2014 2,4. Объединяя селективное истощение и синтез кДНК со строительством библиотеки tagmentation, общее время процесса был уменьшен на ~ 2 дней с предыдущими методами лигирования адаптеров. Совсем недавно, этот протокол был использован международными сотрудниками и другими с большим успехом 15,16 и будут развернуты в лаборатории в Западной Африке для поддержки местных геномики на основе научных исследований и диагностики 17.
Протокол, описанный здесь, использует случайные праймеров для подготовки кДНК вирусных РНК-сл библиотек. В отличие предыдущих вирусных РНК-сл подходов, она не требует априорного знания последовательности данных или сложного и трудоемкого дизайна праймеров для конкретного вируса или клады. Этот метод может быть применен к любой вирусной РНК образца. Например, он был использован для создания вирусного контента из обоих лихорадку Эболаи образцы Ласса 6. Протокол также может быть использован для хоста транскриптомных, метагеномных и обнаружения патогена секвенирования проектов 1.
Важным шагом протокола направлена РНКазы Н пищеварение, высокую пропускную способность, низкая стоимость метода для удаления нежелательного носителя и хозяина РНК из вирусных образцов. Избирательное стадия истощения протокола использует множество компонентов и требует мастерства и точности. Дополнительное время и следует соблюдать осторожность во время начальной установки.
Поскольку большинство клинических сыворотки и плазмы образцы часто имеют очень мало материала нуклеиновых кислот, загрязнение и потеря образца являются общими. Чтобы избежать этих проблем, особое внимание следует соблюдать осторожность при использовании этого протокола. Во-первых, РНК очень восприимчивы к деградации; поэтому все районы должны быть чистыми и свободными от нуклеаз. Во- вторых, чтобы идентифицировать образцы , пригодные для использования в данном протоколе, QRT-ПЦР для обеих РНК – хозяина и вируса следует использовать для количественной оценки 5,6 </suр>. При сравнении ввода суммы с результатами секвенирования из протокола, секвенирование успеха (т.е. генерация достаточных данных для полной вирусной сборки) коррелируют с образцами , которые содержали по меньшей мере , 100 мкг общей РНК и 1000 копий вируса. В-третьих, воздействие окружающей среды источники нуклеиновых кислот, их следует избегать. Протокол указано здесь делается в кабинете биологической безопасности для техники безопасности и для ограничения загрязнителей окружающей среды. Кроме того, наша группа и другие заметили , что коммерческие ферменты могут быть еще одним источником загрязнения бактериальных нуклеиновых кислот в низких входных выборок 6,18. Использование чистого рабочего пространства (например, ПЦР капот, биозащитой) и отрицательный контроль (например, вода или буфер) поможет облегчить и отслеживать загрязнения, соответственно. Для образцов с <100 пг общей РНК, только поли (гА) РНК-носитель, не рРНК, должны быть истощены, чтобы гарантировать результаты секвенирования высокого качества при одновременном ограничении потери материала. Для оченьнизкие входные выборки, методы амплификации кДНК-могут быть более подходящими 19, хотя и поли (гА) носитель должен быть удален до синтеза кДНК.
Истощение хозяина рРНК обогащают для вирусного контента в библиотеках секвенирования и применима к различным коллекциям образцов , включая сыворотки или плазмы, а также несколько типов тканей от грызунов и приматов , отличных от человека 5,6. В нечеловеческих организмов, совместив чтений к 28S рРНК оставались после истощения, предлагая 28S рРНК менее консервативными между людьми и другими видами 6,20. При использовании этого метода с нечеловеческими изолятов, может быть необходимо дополнить с олигонуклеотидами ДНК , комплементарных расходящихся последовательностей рРНК конкретного хоста 3,21.
Поскольку протокол является несмещенной, вирусный читает может представлять лишь малую часть от общего содержания библиотеки. Хотя рРНК является наиболее распространенным видов РНК-хозяина и лишь небольшой процент рРНК (читает0; 1%) обнаружены после селективного истощения, все другие хост – РНК (например, мРНК) остается после того, как истощение и может объяснить многие секвенирование считывает из образца. Поэтому "передискретизации" (т.е. oversequencing) отдельные библиотеки требуется для того , чтобы иметь достаточное освещение для сборки и вирусных вариантов вызовов. Для наших исследований, мы пытаемся последовательность ~ 20 миллионов просмотров на пробу , чтобы иметь достаточную глубину для анализа вирусного генома и связанного вариантов, а также содержание метагеномной 2,5. Для метагеномных и возбудителем исследований обнаружения, важно отметить, что загрязняющие ДНК хозяина удаляют с помощью ДНКазы пищеварения. Поэтому вирусы и другие болезнетворные микроорганизмы, которые содержат геномы ДНК, могут быть потеряны в ходе процесса, однако промежуточные продукты РНК могут все еще быть секвенированы.
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).
96-Well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |