This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.
ここでは、 デノボアセンブリおよび臨床的および生物学的供給源から収集されたウイルスゲノムのホスト内のバリアントの呼び出しを可能にする次世代のRNAの塩基配列決定プロトコルの概要を説明します。この方法は、公平かつ普遍的です。それは、cDNA合成のためのランダムプライマーを使用し、ウイルス配列のコンテンツの予備知識を必要としません。含むポリ(RA)キャリアとリボソームRNA – – ウイルスRNAサンプルからライブラリー構築する前に、選択のRNase Hベースの消化は、不要なRNAを枯渇させるために使用されます。選択的枯渇は、データ品質とウイルスRNAシーケンシングライブラリを読み込んでユニークな数の両方を向上させます。それは全体のライブラリー構築時間を低減するようにまた、トランスポザーゼ系」tagmentation」ステップは、プロトコルで使用されています。プロトコルは、血液および組織の両方からの600以上のラッサ熱とエボラウイルスサンプル-を含むコレクションの急速な深いシーケンシングは、隔離、および他の微生物ゲノム研究に広く適用可能である可能となりました。
臨床情報源からのウイルスの次世代シーケンシングは、送信および感染症の疫学、ならびに診断ヘルプサポート小説、ワクチンや治療の開発に知らせることができます。ランダムプライマーを用いてcDNA合成は、検出およびアセンブリ発散からゲノムの共感染あるいは新規ウイルス1,2を可能にしました。他の公正な方法と同様に、不要な汚染物質は、多くのシーケンシングを読み取って、負の配列決定の結果に影響を与える占めます。ホストおよびポリ(RA)キャリアRNAは、多くの既存のウイルスサンプルのコレクションに存在する汚染物質です。
プロトコルは公平全RNA-seqのに基づいて、深いシーケンシングRNAウイルスのゲノムの効率的かつ費用対効果の高い方法を説明します。この方法は、不要なホストリボソームとキャリアRNAを除去するためのRNase H選択的枯渇のステップ3を利用しています。選択的枯渇は、ウイルスコンテンツ( 図1)のために豊かにし、配列決定データの全体的な品質を向上させます臨床サンプルから( 図2)。また、tagmentationは、著しくライブラリー構築時間を低減するようなプロトコルに適用されます。これらの方法は、迅速にエボラおよびラッサウイルスゲノム2,4,5の大規模なデータセットを生成するために使用されており、RNAウイルスの広い範囲を研究するために使用することができます。最後に、このアプローチは、ヒトのサンプルに限定されるものではありません。選択的な枯渇の有用性は、ラッサ感染げっ歯類および非ヒト霊長類疾患モデル5,6から採取した組織サンプルで実証されました。
図1.全RNAのコンテンツは、コンテンツ全体(RNA入力)を開始しています。選択的枯渇を使用したラッサウイルス、コンテンツの充実を反映し、ユニークなラッサウイルス(LASV)の濃縮は、9つの異なる臨床分離株からのrRNA枯渇時(ライブラリコンテンツ)を読み込みます。この図は、6から変更されています<em>。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.品質向上シングキャリアRNA枯渇。ポリシークエンシングサイクル(RA)あたりの中央値ベースの資質は、ラッサウイルスライブラリ(赤)とQCレポート13からの制御(黒ライブラリに観察されなかったキャリアを、)-contaminated 後 。両方が1を読み、ペアエンドの2を読んで、ライブラリのBAMファイルにマージされ、品質スコアは、各ベースで示されている読み込みます。この図は、6から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
抽出から直接ライブラリのウイルスRNA-seqのプロトコルの詳細建設RNAは、臨床的および生物学的サンプルから収集します。個人の安全を確保するために、全てのウイルスの血清、血漿および組織サンプルは、RNA抽出前に適切な緩衝液で不活性化されるべきです。いくつかの不活性化および抽出キットにおいて、キャリアポリ(RA)RNAが含まれています。これは初期のRNase H選択的枯渇ステップの間に削除されます。完全な回復に基づいて、キャリアRNAの予想濃度は100 ngの/μlです。プロトコルでは、110 ngの/μlのオリゴdT RNA(1.1倍のキャリア濃度)を枯渇するために使用されます。ポリ(RA)担体が試料中に存在しない場合は、オリゴ(dT)が枯渇する前に添加されるべきではありません。
以下のプロトコルは、(250μlの容量まで)PCRプレート形式で24の反応のために設計されています。このプロトコルの以前のバージョンはMatranga らに報告された。6。
概説的なアプローチは、堅牢、普遍的、迅速なシーケンシングを可能にし、2014年流行の2,4の間にエボラウイルスの配列を決定するために使用されました。 tagmentationライブラリー構成の選択的枯渇及びcDNA合成を結合することにより、全体の処理時間は、前のアダプターライゲーション方法から1~2日後に減少しました。最近では、このプロトコルは大成功15,16との国際共同研究者らによって採用されたと地元ゲノミクスベースの調査研究および診断17をサポートするために西アフリカのラボに展開されます。
ここで説明するプロトコルは、ウイルスRNA-seqのライブラリのcDNAを準備するために、ランダムプライマーを使用しています。前回のウイルスRNA-seqのアプローチとは異なり、それは特定のウイルスまたはクレードのための配列データや精巧で時間のかかるプライマー設計の事前知識を必要としません。この方法は、任意のウイルスRNA試料に適用することができます。例えば、エボラウイルスの両方からコンテンツを生成するために使用されましたそして、ラッササンプル6。プロトコルは、ホスト・トランスクリプトーム、メタゲノムおよび病原体検出の配列決定プロジェクト1のために使用することができます。
プロトコルの重要なステップは、RNアーゼH消化、高スループット、ウイルスのサンプルから不要なキャリアと宿主RNAを除去するための低コストの方法を対象としています。プロトコルの選択的枯渇のステップは、多くのコンポーネントを使用し、スキルと精度を必要とします。余分な時間とケアは、初期設定時に注意すべきです。
ほとんどの臨床血清および血漿サンプルは、多くの場合、非常に少ない核酸物質を有するので、汚染および試料の損失が一般的です。このプロトコルを使用する場合、これらの問題を回避するために、特別な注意が払われるべきです。まず、RNAが分解に対して非常に敏感です。したがって、すべてのエリアは清潔でヌクレアーゼの自由であるべきです。第二に、このプロトコルで使用するのに適したサンプルを識別するために、宿主RNAとウイルスの両方のためのqRT-PCRアッセイは、定量5,6のために使用されるべきです</suP>。入力を比較すると、少なくとも100 pgのトータルRNAとウイルスの千のコピーを含まれるサンプルと相関プロトコル、シークエンシングの成功(フルウイルス構築のための十分なデータがすなわち、発生)からの配列決定の結果に相当します。第三に、核酸の環境源への曝露を避けるべきです。ここで概説プロトコルは、安全上の注意事項は、環境汚染物質を制限するための安全キャビネットで行われます。また、当社グループなどが市販酵素は、低入力サンプル6,18中の細菌の核酸を汚染する別の源になる可能性があることに気づきました。クリーンな作業領域( 例えば 、PCRフード、安全キャビネット)および陰性対照( 例えば 、水または緩衝液)の使用は、それぞれ、軽減と汚染を追跡します。 <全RNAの100 pgの、唯一のポリ(RA)キャリアRNA、ないのrRNAとサンプルについては、材料の損失を制限しながら、高品質の配列決定結果を確実にするために枯渇されるべきです。以下のために非常にポリ(RA)キャリアはcDNA合成の前に除去しなければならないが、低入力サンプルは、cDNAの増幅方法は、19より適切であり得ます。
宿主rRNAの枯渇は、配列ライブラリー中のウイルス含有量を富化し、血清又は血漿、及びげっ歯類および非ヒト霊長類5,6からの組織の複数のタイプを含む異なるサンプルのコレクションに適用可能です。ヒト以外の生物では、28S rRNAのに整列させることは28S rRNAのは、人間と他の種6,20間の少ない保存されて示唆し、枯渇した後に残った読み取り。非ヒト分離株で、この方法を使用する場合、特定のホスト3,21の発散rRNA配列に相補的なDNAオリゴと補完する必要があるかもしれません。
プロトコルは公平であるので、ウイルスは、全ライブラリの内容のごく一部を表すことができる読み取ります。 rRNAが宿主RNAの最も豊富な種であるとrRNAのわずかな割合は、(読み込みが0;)1%が選択的枯渇後に発見され、他のすべての宿主RNA( 例えば 、mRNA)が枯渇した後に残る、多くのシーケンシングは、サンプルからの読み取りを説明することができます。したがって「オーバーサンプリング」( すなわち 、oversequencing)個々のライブラリは、ウイルスアセンブリおよびバリアントの呼び出しのための十分なカバレッジを持っているために必要とされます。私たちの研究のために、私たちは順番にしよう〜2000万は、ウイルスゲノムおよび関連する変異体の解析のために十分な深さだけでなく、メタゲノムコンテンツ2,5を持っているために、サンプルごとに読み込みます。メタゲノムおよび病原体検出の研究のために、汚染宿主DNAは、DNアーゼ消化によって除去されることに留意することが重要です。したがって、ウイルスおよびDNAゲノムを含む他の病原体は、しかし、RNA中間体がまだ配列決定され得る、プロセスの間に失われることがあります。
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).
96-Well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |