This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.
여기서 우리 드 노보 어셈블리 및 임상 적, 생물학적 소스로부터 수집 된 바이러스 게놈 내 호스트 변형 통화를 가능하게하는 차세대 RNA 시퀀싱 프로토콜 개요. 이 방법은 편견과 보편적이다 그것은 cDNA 합성을위한 랜덤 프라이머를 사용하고 바이러스 시퀀스 내용의 사전 지식이 필요하지 않습니다. 를 포함하는 폴리 (RA) 캐리어와 리보솜 RNA – – 바이러스 RNA 샘플에서 라이브러리를 구성하기 전에, 선택의 RNase H 기반의 소화는 원치 않는 RNA를 소모하는 데 사용됩니다. 선택적 공핍 데이터 품질과 고유의 수가 바이러스 RNA 서열 라이브러리 판독 모두를 향상시킨다. 그것은 전체 라이브러리 구축 시간을 감소시키기 때문에 또한, 트랜스 기반 'tagmentation'단계는 프로토콜에서 사용된다. 이 프로토콜은 신속하게 깊은 시퀀싱을 사용하도록 설정 한 600 라사와 에볼라 바이러스 샘플을 포함한 혈액과 조직 모두 분리 및 다른 미생물 유전체 연구에 광범위하게 적용에서 컬렉션.
임상 소스에서 바이러스의 차세대 시퀀싱 전송 및 감염의 역학뿐만 아니라 진단 도움말 지원 소설, 백신 및 치료제 개발을 알릴 수 있습니다. 랜덤 프라이머를 이용하여 cDNA 합성을 발산, 공동 감염 게놈 또는 새로운 바이러스 1, 2의 검출 및 조립을 허용했다. 다른 편견 방법과 마찬가지로, 원치 않는 오염 물질이 많은 순서 읽기 및 부정적인 시퀀싱 결과에 영향을 차지한다. 호스트 및 폴리 (RA) 캐리어 RNA는 많은 기존의 바이러스 샘플 컬렉션에 존재하는 오염 물질이다.
프로토콜은 바이어스 총 RNA-서열에 기초한 깊이 시퀀싱 RNA 바이러스 게놈의 효율적이고 경제적 인 방법을 설명한다. 본 방법은 원하지 않는 호스트 리보솜 RNA 캐리어를 제거하기의 RNase H 선택적 공핍 3 단계를 이용한다. 선택적 결핍 바이러스 콘텐츠 (도 1)에 대한 풍부 시퀀싱 데이터의 전체 품질을 향상임상 샘플에서 (그림 2). 또한 tagmentation은 크게 라이브러리 생성 시간을 단축 같은 프로토콜에 적용된다. 이러한 방법은 신속하고 라사 에볼라 바이러스 게놈 2,4,5- 큰 데이터 세트를 생성하는데 사용되었으며, RNA 바이러스의 광범위한 연구하기 위해 사용될 수있다. 마지막으로, 방법은 인간의 샘플에 제한되지 않는다; 선택적 고갈의 유틸리티는 라사에 감염된 설치류와 인간이 아닌 영장류 질환 모델 5,6에서 수집 한 조직 샘플에서 증명되었다.
그림 1. 총 RNA 콘텐츠 농축 선택적 고갈를 사용 라사 바이러스 내용의 반영. 9 가지 임상 분리에서 rRNA의 고갈에 따라 전체 콘텐츠 (RNA 입력) 및 고유 라사 바이러스 (LASV)의 농축 읽기 (라이브러리 내용을) 시작. 이 수치는 6에서 수정되었습니다 <em>. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 높은 품질 시퀀싱 캐리어 RNA 고갈. 폴리 순서주기 (RA) 당 중간 기본 자질 라사 바이러스 라이브러리 (빨간색) 및 품질 관리 보고서 (13)로부터 제어 (검은 라이브러리에서 관찰없는 캐리어를) -contaminated 후. 모두 1을 읽고 쌍 끝의 2 라이브러리 BAM 파일에 병합 읽기 및 품질 평가 점수는 각 기지에 표시됩니다 읽어 보시기 바랍니다. 이 수치는 6에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추출에서 직접 라이브러리의 바이러스 성 RNA-SEQ 프로토콜 세부 건설RNA는 임상 적, 생물학적 시료에서 수집. 개인의 안전을 보장하기 위해, 모든 바이러스 혈청, 혈장 및 조직 샘플은 RNA 추출하기 전에 적절한 버퍼에서 불 활성화되어야한다. 일부 불 활성화 및 추출 키트에서, 캐리어 폴리 (RA) RNA가 포함되어 있습니다; 이것은 초기의 RNase H 선택적 고갈 단계에서 제거됩니다. 전체 복구에 기초하여, 캐리어의 예상되는 RNA 농도는 100 NG / μL이다. 프로토콜에서, 110 NG / μL 올리고 DT RNA (1.1 캐리어 농도)는 공핍 사용된다. 폴리 (RA) 캐리어는 샘플에 존재하지 않으면, 올리고 (DT)가 고갈 전에 첨가되어서는 안된다.
다음 프로토콜 (250 μL 부피까지) PCR 플레이트 형식 (24)의 반응을 위해 설계된다. 이 프로토콜의 이전 버전 Matranga, 등으로보고되었다. (6).
개설 된 접근 방식은 강력하고 보편적 인, 급속한 시퀀싱을 가능하게하고 2014 년 발발의 2,4- 동안 에볼라 바이러스를 시퀀싱에 사용되었다. tagmentation 라이브러리 구축 선택적 공핍과 cDNA 합성을 연결함으로써, 전체 처리 시간은 이전 어댑터 라이 게이션 방법으로 1 ~ 2 일까지 감소되었다. 최근에,이 프로토콜은 큰 성공 (15, 16)와 국제 공동 작업자 및 다른 사람에 의해 사용되었다, 지역 유전체학 기반 조사 연구 및 진단 (17)를 지원하기 위해 서 아프리카의 실험실에 배포됩니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 바이러스 RNA-SEQ의 cDNA 라이브러리를 제조하는 임의의 프라이머를 사용한다. 이전의 바이러스 성 RNA-서열 방식과는 달리, 그것은 어떤 특정 바이러스 또는 계통 군에 대한 시퀀스 데이터 또는 정교하고 시간이 많이 소요되는 프라이머 디자인의 사전 지식을 필요로하지 않는다. 이 방법은 임의의 RNA 바이러스의 샘플에 적용될 수있다. 예를 들면, 모두 에볼라 바이러스로부터 콘텐츠를 생성하는 데 사용 된그리고 라사 샘플 6. 프로토콜은 호스트 transcriptomic, 병원체 군 유전체학 및 검색 서열 프로젝트 하나에 사용될 수있다.
프로토콜의 중요한 단계의 RNase H 소화 높은 처리량 바이러스 샘플로부터 원하지 않는 캐리어 및 숙주 RNA를 제거하기위한 저비용 방법 대상. 프로토콜의 선택적 공핍 단계는 많은 부품을 사용하여 기술과 정확성을 요구한다. 여분의 시간과주의가 초기 설정시주의해야한다.
대부분의 임상 혈청 및 혈장 시료는 종종 아주 작은 핵산을 가지고, 오염 시료 손실이 일반적이다. 이 프로토콜을 사용하는 경우 이러한 문제를 방지하기 위해 특별한주의를 기울여야합니다. 첫째, RNA가 분해에 매우 민감하다; 따라서 모든 영역은 깨끗하고 클레아 없어야합니다. 둘째,이 프로토콜에 사용하기에 적합한 샘플을 식별하는 두 호스트 및 RNA 바이러스 QRT-PCR 분석은 정량 5,6- 사용해야 </suP>. 입력을 비교하는 프로토콜에서 시퀀싱 결과, 시퀀싱 성공 금액을 때 (즉, 전체 바이러스 어셈블리에 대한 충분한 데이터의 생성) 적어도 100 페이지 총 RNA 바이러스의 1,000 복사본을 포함 샘플 상관 관계. 핵산의 환경 소스 셋째, 노출은 피해야한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 안전주의 사항에 대한 바이오 안전성 캐비닛 및 환경 오염 물질을 제한하는 수행됩니다. 또한, 우리 그룹과 다른 상업 효소는 낮은 입력 샘플 6,18에서 세균의 핵산을 오염의 또 다른 원인이 될 수 있다는 것을 발견했습니다. 깨끗한 작업 공간 (예를 들어, PCR 후드, 바이오 안전성 캐비닛) 및 음성 대조군의 사용 (예를 들면, 물 또는 버퍼)는 각각 완화 및 오염을 추적하는 데 도움이됩니다. 와 샘플은 <총 RNA의 100 페이지는, 단지 폴리 (RA) 캐리어 RNA하지 rRNA의은, 재료의 손실을 제한하면서 고품질의 시퀀싱 결과를 확인하기 위해 소모해야한다. 매우폴리 (RA) 캐리어는 cDNA 합성 전에 제거되어야하지만 낮은 입력 샘플 cDNA를 증폭 방법 (19)에 더 적합 할 수있다.
숙주 rRNA의 고갈 시퀀싱 라이브러리 바이러스 콘텐츠 풍부 혈청 또는 혈장, 설치류 및 비 – 인간 영장류에서 5,6- 조직의 여러 유형을 포함하여 다양한 샘플 수집에 적용 가능하다. 28S rRNA의이 고갈 후 남아에 인간이 아닌 생물에서, rRNA의 인간과 다른 종 6,20 사이에 덜 보존이다 28S를 제안, 정렬 읽기. 비인간 분리하여이 방법을 사용하면, 특정 호스트 3,21의 발산 rRNA의 서열에 상보적인 올리고 DNA로 보충 할 필요가있다.
프로토콜이 편향되기 때문에, 바이러스의 전체 라이브러리 콘텐츠의 작은 부분을 나타낼 수있다 읽는다. rRNA의 가장 풍부한 숙주 RNA 종에만 rRNA의 작은 비율 판독한다 (하지만0 1 %)을 선택적으로 파괴 한 후, 다른 모든 호스트 RNA (예를 들어, mRNA를) 고갈 후 남아 많은 순서 샘플에서 읽기를 차지하고있다 발견된다. 따라서 "오버 샘플링"(즉, oversequencing) 개인 라이브러리는 바이러스 조립 및 변형 통화에 대한 충분한 보상을하기 위해 필요합니다. 우리의 연구를 위해, 우리는 순서에 ~ 20000000 바이러스 성 게놈 및 관련 변종의 분석을위한 충분한 깊이뿐만 아니라 군 유전체학 콘텐츠 2,5을 가지고 샘플 당 읽기를 시도합니다. 군 유전체학 및 병원체 발견 연구를 들면, 숙주 DNA를 오염하는 것은 DNase의 분해에 의해 제거된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서 게놈 DNA를 포함하는 바이러스 및 기타 병원체 과정에서 손실 될 수 있지만 RNA 중간체 여전히 서열화 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).
96-Well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |