This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.
Hier schetsen we een next-generation sequencing RNA-protocol dat de novo assemblages en intra-gastheer variant oproepen van virale genomen verzameld uit klinische en biologische bronnen mogelijk maakt. De methode is onpartijdige en universeel; gebruikt het willekeurige primers voor cDNA-synthese en vereist geen voorkennis van de virale sequentie inhoud. Voordat bibliotheek constructie wordt selectieve RNase H-gebaseerde vertering gebruikt om ongewenste RNA afbreken – met inbegrip van poly (RA) drager en ribosomaal RNA – van het virale RNA-monster. Selectieve verwijdering verbetert de kwaliteit data en het aantal unieke leest viraal RNA sequentie bibliotheken. Bovendien wordt een transposase-based 'tagmentation' stap gebruikt volgens het protocol voor het algemeen bibliotheek bouwtijd vermindert. Het protocol is een snelle diepe sequencing van mogelijk meer dan 600 Lassa en Ebola-virus monsters, waaronder collecties van zowel bloed en weefsel isoleert-en is breed toepasbaar op andere microbiële genomics studies.
Next generation sequencing van virussen uit klinische bronnen kan de transmissie en de epidemiologie van infecties, alsmede hulp ondersteuning nieuwe diagnostische, vaccins en therapeutische ontwikkeling op de hoogte. cDNA-synthese met behulp van willekeurige primers heeft de opsporing en assemblage van genomen van uiteenlopende, co-infecterende of zelfs nieuwe virussen 1,2 toegestaan. Net als bij andere onpartijdige methoden, ongewenste verontreinigingen bezetten vele sequencing leest en een negatieve invloed sequencing resultaten. Gastheer en poly (RA) carrier RNA verontreinigingen aanwezig in vele bestaande virale monstercollecties.
Het protocol beschrijft een efficiënte en kosteneffectieve manier diepe sequencing RNA virusgenomen gebaseerd op onpartijdige totale RNA-seq. De methode maakt gebruik van een RNase H selectieve uitputting stap 3 om ongewenste gastheer ribosomaal en carrier RNA te verwijderen. Selectieve verwijdering verrijkt virale inhoud (Figuur 1) en verbetert de algehele kwaliteit van sequentiegegevens(Figuur 2) uit klinische monsters. Bovendien is tagmentation toegepast op het protocol omdat het aanzienlijk vermindert bibliotheek bouwtijd. Deze werkwijzen zijn gebruikt om snel genereren grote datasets van Ebola en Lassa virus genoom 2,4,5 en kan worden gebruikt om een groot aantal RNA-virussen bestuderen. Tenslotte is de benadering niet beperkt tot humane stalen; het nut van selectieve depletie werd aangetoond weefselmonsters verzameld van Lassa-geïnfecteerde knaagdieren en niet-humane primaten ziektemodellen 5,6.
Figuur 1. Totaal RNA Content Weerspiegelt Verrijking van Lassa virus content met behulp van Selective Uitputting. Vanaf globale inhoud (RNA-ingang) en verrijking van unieke Lassa virus (LASV) leest (Bibliotheek inhoud) op rRNA uitputting uit negen verschillende klinische isolaten. Dit cijfer is gewijzigd van 6 <em>. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Hogere kwaliteit Sequencing Na Carrier RNA Uitputting. Median basis kwaliteiten per sequencing cyclus van poly (RA) -contaminated Lassa virus libraries (rood) en controle (geen carrier waargenomen in de bibliotheek, zwart) van QC verslag 13. Zowel lezen 1 en 2 lezen van gepaarde end leest worden samengevoegd in de bibliotheek BAM-bestand en de kwaliteit scores worden getoond bij elke basis. Dit cijfer is gewijzigd van 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het virale RNA-seq protocol gegevens bouw van bibliotheken rechtstreeks uit gehaaldRNA verzameld uit klinische en biologische monsters. Om persoonlijke veiligheid te garanderen, moeten alle virale serum, plasma en weefselmonsters worden geïnactiveerd in geschikte buffers voorafgaand aan RNA-extractie. In sommige inactivatie en extractie kits, wordt carrier poly (RA) RNA opgenomen; dit zal tijdens de eerste RNase H selectieve uitputting stap worden verwijderd. Op basis van volledig herstel, de verwachte concentratie van carrier-RNA is 100 ng / ul. In het protocol, 110 ng / ul oligo dT RNA (1.1x ladingdrager concentratie) wordt gebruikt voor depletie. Als poly (rA) drager niet in het monster, dan oligo (dT) niet voorafgaand aan uitputting toegevoegd.
Het volgende protocol is geschikt voor 24 reacties in PCR plaatformaat (maximaal 250 pi volume). Een eerdere versie van dit protocol werd gemeld in Matranga, et al. 6.
De geschetste aanpak maakt robuuste, universele, snelle sequencing en werd gebruikt voor het sequentiëren van Ebola-virus tijdens de 2014 uitbraak 2,4. Door het koppelen van selectieve uitputting en cDNA-synthese met tagmentation bibliotheek bouw, werd het totale proces tijd verminderd met ~ 2 dagen na de vorige adapter ligatie methoden. Meer recent werd dit protocol in dienst van internationale medewerkers en anderen met groot succes 15,16 en zal worden ingezet om labs in West-Afrika aan de lokale richt op innovatief gentechnologisch onderzoeken en diagnostiek 17 te ondersteunen.
De hier beschreven protocol gebruikt willekeurige primers voor cDNA bereiden viraal RNA-seq bibliotheken. In tegenstelling tot eerdere viraal RNA-seq benaderingen, het vereist geen voorkennis van sequentiegegevens of ingewikkelde en tijdrovende primer ontwerp voor een bepaald virus of clade. De werkwijze kan worden toegepast op elk viraal RNA-monster. Zo werd het gebruikt om virale content van beide Ebola genererenen Lassa monsters 6. Het protocol kan ook worden gebruikt voor host transcriptomics, metagenomic en pathogeen ontdekking sequencing projecten 1.
Een kritische stap van het protocol is gericht RNase H spijsvertering, een high-throughput, goedkope manier voor het verwijderen van ongewenste vervoerder en gastheer RNA van virale monsters. De selectieve uitputting stap van het protocol maakt gebruik van een groot aantal componenten en vereist vaardigheid en nauwkeurigheid. Extra tijd en zorg moeten worden genomen tijdens de eerste installatie.
Aangezien de meeste klinische serum- en plasmamonsters vaak weinig nucleïnezuurmateriaal, vervuiling en schade monster zijn gebruikelijk. Om deze problemen te voorkomen, moet speciale zorg worden genomen bij het gebruik van dit protocol. Ten eerste RNA is zeer gevoelig voor afbraak; daarom alle gebieden moeten schoon en vrij van nucleasen zijn. Anderzijds monsters geschikt voor gebruik in dit protocol geïdentificeerd dient qRT-PCR assays voor zowel gastheer RNA en virus worden gebruikt voor kwantificering 5,6 </sup>. Bij het vergelijken van ingang bedraagt met sequencing resultaten van het protocol, sequencing succes (dat wil zeggen, het genereren van voldoende gegevens voor een volledige virale montage) gecorreleerd met monsters die ten minste 100 pg totaal RNA en 1.000 exemplaren van het virus bevatte. Ten derde, verhoogde blootstelling aan bronnen van nucleïnezuren moeten worden vermeden. De hier geschetste protocol wordt gedaan in een bioveiligheid kast voor veiligheidsmaatregelen en voor het beperken van milieuverontreinigende stoffen. Bovendien, onze groep en anderen hebben gemerkt dat commerciële enzymen een andere bron van verontreinigende bacteriële nucleïnezuren in lage input monsters 6,18 kan zijn. Het gebruik van een schone werkplek (bijvoorbeeld PCR kap, bioveiligheid kast) en negatieve controles (bijvoorbeeld water of buffer) zal helpen verlichten en besmetting te volgen, respectievelijk. Voor monsters met <100 pg totaal RNA, enkel poly (rA) carrier RNA, rRNA niet moet worden uitgeput naar hoge kwaliteit sequencing resultaten maar beperkt materiaalverlies. voor zeerlage ingangsmonsters kan cDNA-amplificatie methoden geschikter 19, alhoewel poly (rA) vervoerder voor de cDNA-synthese moet worden verwijderd.
De uitputting van gastheer rRNA verrijkt virale inhoud sequencing bibliotheken en is toepasbaar op verschillende monsterverzamelingen zoals serum of plasma, en meerdere soorten weefsels van knaagdieren en primaten 5,6. In niet-humane organismen, leest uitgelijnd tegen 28S rRNA overbleven na uitputting, hetgeen suggereert 28S rRNA minder geconserveerd tussen mens en andere diersoorten 6,20. Bij gebruik van deze methode met niet-humane isolaten, kan het nodig zijn om te vullen met DNA-oligo's complementair aan de uiteenlopende rRNA sequenties van de specifieke gastheer 3,21.
Aangezien het protocol is onbevooroordeeld, viraal leest kan slechts een klein deel van de totale inhoud bibliotheek vertegenwoordigen. Hoewel rRNA de meest voorkomende soort van gastheer RNA en slechts een klein percentage van rRNA leest (0, 1%) volgen op selectieve depletie, zullen alle andere gastheer RNA (bijvoorbeeld mRNA) na uitputting blijven en kan verantwoordelijk zijn voor vele sequentiebepaling leest van het monster. Daarom "oversampling" (dwz oversequencing) afzonderlijke libraries nodig om voldoende dekking voor virale assemblage en variant oproepen. Voor onze studies, proberen we opeenvolging ~ 20 miljoen leest per monster voldoende diepte voor de analyse van virale genoom en de bijbehorende varianten evenals metagenomic inhoud van 2,5 te hebben. Voor metagenomic en pathogeen ontdekking studies, is het belangrijk op te merken dat verontreinigend gastheer DNA wordt verwijderd door digestie met DNase. Daarom virussen en andere pathogenen die DNA-genomen bevatten mogelijk verloren tijdens het proces echter RNA tussenproducten kunnen nog worden gesequenced.
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).
96-Well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |