This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.
כאן אנו מתארים פרוטוקול רצף RNA הדור הבא המאפשר דה נובו אסיפות ושיחות גרסת תוך שורה של הגנום נגיפי שנאסף ממקורות קליניים וביולוגיים. השיטה היא משוחדת ואוניברסלית; היא משתמשת פריימרים אקראיים לסינתזת cDNA ואינה דורשת ידע מוקדם של תוכן רצף ויראלי. לפני בניית ספרייה, סלקטיבית RNase H מבוסס עיכול משמש כדי לרוקן RNA רצוי – כולל פולים (ע"ר) מוביל ו- RNA ריבוזומלי – מן מדגם RNA ויראלי. דלדול סלקטיבי משפר הן את איכות הנתונים ומספר ייחודי קורא בספריות רצף RNA ויראלי. יתר על כן, הצעד מבוסס transposase 'tagmentation' משמש בפרוטוקול כפי שהוא מקטין את זמן בניית ספרייה הכולל. הפרוטוקול אפשר רצף עמוק מהיר של מעל 600 לסה דגימות-כולל נגיף האבולה אוסף משני דם ורקמות מבודדות-והוא החלים רחב ללימודים הגנומיקה חיידקים אחרים.
רצף הדור הבא של וירוסים ממקורות קליניים יכול להודיע הולכת האפידמיולוגיה של זיהומים, כמו גם רומן תמיכת עזרת אבחון, חיסון ופיתוח טיפולי. סינתזה cDNA באמצעות פריימרים אקראיים אפשרה זיהוי והרכבה של הגנום מ-מדביק שיתוף מסתעף, או אפילו וירוסים רומן 1,2. כמו שיטות משוחדות אחרות, מזהמים לא רצויים לכבוש רצף רב קורא על תוצאותיהן רצף שלילי. מארח פולי RNA המוביל (ע"ר) הם מזהמים באוספי מדגם ויראלי רבים קיימים.
הפרוטוקול מתאר דרך יעילה וחסכונית של הגנום וירוס RNA רצף עמוק מבוסס על-seq רנ"א הכל משוחדת. השיטה משתמשת צעד דלדול סלקטיבית RNase H 3 להסיר ריבוזומלי מארח רצוי ו- RNA המוביל. דלדול סלקטיבי מעשיר עבור תוכן ויראלי (איור 1) ומשפר את האיכות הכוללת של נתוני רצף(איור 2) מדגים קליני. יתר על כן, tagmentation מוחל על הפרוטוקול כמו שהיא מפחיתה באופן משמעותי את זמן בניית ספרייה. שיטות אלו שימשו להפקת מערכי נתונים גדולים במהירות של הגנום וירוס אבולה לסה 2,4,5 וניתן להשתמש בו כדי ללמוד מגוון רחב של וירוסים RNA. לבסוף, הגישה אינה מוגבלת דגימות אנושיות; השירות של דלדול סלקטיבית הודגם על דגימות רקמה שנאספו מכרסמים נגועים לסה ומודלי מחל הפרימטים לא אנושי 5,6.
תוכן איור 1. סך RNA משקף העשרת תוכן וירוס לסה שימוש סלקטיבי אזילה. החל תוכן הכולל (קלט RNA) והעשרה של נגיף לסה ייחודי (LASV) קורא (תוכן הספריה) על דלדול rRNA מתשע מבודד קליניים שונים. נתון זה יש הבדל בין תמונה 6 <em>. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. איכות גבוהה יותר רצף לאחר Carrier RNA אזילה. איכויות בסיס חציון מחזור רצף של פולי (ע"ר) -contaminated נגיף לסה ספריות (אדום) ובקרה (לא מוביל נצפה בספרייה, שחור) מדווח QC 13. שניהם לקרוא 1 ולקרוא 2 של סוף לזווג קורא ימוזגו בקובץ BAM הספרייה ואת ציוני איכות מוצגים בכל הבסיס. נתון זה יש הבדל בין 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בניית פרטי פרוטוקול RNA-seq ויראלי של ספריות ישירות חילוץRNA שנאסף דגימות קליניות וביולוגיות. כדי להבטיח ביטחונם אישי, כל בסרום ויראלי, דגימות הפלזמה ורקמות צריכות להיות מובטלות מאגרים מתאימים לפני מיצוי RNA. בחלק ערכות איון והפקה, פולי מוביל (ע"ר) RNA כלול; זו תוסר במהלך שלב דלדול סלקטיבית הראשוני RNase H. בהתבסס על התאוששות מלאה, הריכוז הצפוי של RNA המוביל הוא 100 ng / μl. בפרוטוקול, 110 ng / אוליגו μl RNA dT (ריכוז המוביל 1.1x) משמש דלדול. אם פולי (ע"ר) ספק אינו נוכחי במדגם, אז אוליגו (DT) לא צריך להתווסף לפני הדלדול.
הפרוטוקול הבא מיועד 24 תגובות בפורמט צלחת PCR (עד 250 נפח μl). גרסה קודמת של פרוטוקול כך מדווחת Matranga, et al. 6.
שהגישה המתוארת מאפשרת חזק, אוניוורסלי, רצף מהיר שמשה רצף נגיף האבולה במהלך 2,4 פרוץ 2014. על ידי צימוד דלדול סלקטיבית סינתזת cDNA עם בניית ספריית tagmentation, הפעם התהליך הכולל הופחת על ידי ~ 2 ימי משיטות קשירת מתאם קודמות. לאחרונה, פרוטוקול זה הועסק על ידי משתפי פעולה בינלאומיים ואחרים בהצלחה רבה 15,16 ו ייפרס מעבדות במערב אפריקה לתמוך מחקרים מבוססי הגנומיקה מקומיים ואבחון 17.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש פריימרים אקראיים להכין cDNA עבור ספריות RNA-seq ויראלי. שלא כמו גישות RNA-seq ויראלי קודמות, זה לא דורש ידע אפריורי של נתוני רצף או משוכלל ונדרש זמן רב עיצוב פריימר עבור וירוס או clade ספציפי. השיטה יכולה להיות מיושמת על כל מדגם רנ"א נגיפי. לדוגמה, שימש אותו כדי ליצור תוכן ויראלי משני אבולהו לסה דגימות 6. הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור transcriptomic מארח, פרויקטי רצף metagenomic ו הפתוגן גילוי 1.
שלב קריטי של הפרוטוקול הוא ממוקד עיכול H RNase, א-תפוקה גבוהה, שיטת עלות נמוכה להסרת ספק רצוי ו- RNA מארח ממדגם ויראלי. צעד הדלדול סלקטיבית של הפרוטוקול עושה שימוש מרכיבים רבים ודורש מיומנות ודיוק. זמן טיפול נוסף יש לנקוט במהלך ההתקנה הראשונית.
כמו רוב דגימות סרום ופלזמה קליניות לעתים קרובות יש מעט מאוד חומר חומצות גרעין, זיהום ואובדן מדגם נפוץ. כדי למנוע בעיות אלה, טיפול מיוחד יש לנקוט בעת שימוש בפרוטוקול זה. ראשית, RNA הוא מאוד רגיש שפל; ולכן בכל התחומים צריכים להיות נקיים של nucleases. שנית, לזהות דגימות מתאימות לשימוש בפרוטוקול זה, מבחני qRT-PCR עבור שניהם RNA מארח הווירוס אמורים לשמש עבור כימות 5,6 </sup>. בהשוואת קלט מסתכמת עם תוצאות רצף מן הפרוטוקול, הצלחת רצף (כלומר, דור נתונים המספיקים להרכבת ויראלי מלאה) בקורלציה עם דגימות שהכילו לפחות 100 pg RNA סך 1,000 עותקים של נגיף. יש להימנע מחשיפה שלישית, מקורות סביבתיים של חומצות גרעין. הפרוטוקול המתואר כאן נעשה בתוך ארון בטיחות ביולוג הוראות בטיחות להגבלת מזהמים סביבתיים. יתר על כן, הקבוצה ואחרים שלנו הבחינו כי אנזימים מסחריים עשויים להיות מקור נוסף של זיהום חיידקי חומצות גרעין בדגימות קלט נמוך 6,18. שימוש סביבת עבודה נקיה (למשל, מכסה מנוע PCR, ארון בטיחות ביולוגי) ובקרות שליליות (למשל, מים או חיץ) יעזרו להקל ולעקוב אחר זיהום, בהתאמה. לקבלת דוגמיות עם <100 pg של רנ"א הכל, רק פולי RNA המוביל (RA), לא rRNA, צריך להיות מדולדל על מנת להבטיח תוצאות רצף באיכות גבוהה תוך הגבלת הפסד של החומר. לקבלת מאודדגימות קלט נמוכות, שיטות הגברת cDNA יכולות להיות יותר מתאימות 19, למרות פולי (ע"ר) מנשא להסירו לפני סינתזת cDNA.
דלדול של המארח rRNA מעשירה עבור תוכן ויראלי בספריות רצף שלכם והיא חלה על אוספים דגימה שונים כולל סרום או פלזמה, וסוגים שונים של רקמות מן מכרסמים פרימטים לא אנושיים 5,6. באורגניזמים שאינם בני אדם, קריאות יישור כדי 28S rRNA שנותר לאחר דלדול, דבר המצביע 28S rRNA הוא פחות משומר בין בני האדם ומינים אחרים 6,20. בעת השימוש בשיטה זו עם בידודים שאינם בני אדם, זה עשוי להיות נחוץ כדי להשלים עם oligos DNA משלים רצפי rRNA מסתעפים של 3,21 המארח הספציפי.
מאז הפרוטוקול הוא משוחד, ויראלי קורא עשוי לייצג רק חלק קטן של תוכן הספריה. למרות rRNA הוא המין הנפוץ ביותר של רנ"א מארח ורק אחוז קטן של rRNA קורא (0; 1%) נמצאים לאחר דלדול סלקטיבית, כל RNA המארח האחר (למשל, mRNA) יישאר לאחר הדלדול עשוי להסביר רצף רב קורא מן המדגם. לכן "oversampling" (כלומר, oversequencing) ספריות פרט נדרשה על מנת לקבל כיסוי מספיק לשיחות הרכבת גרסת ויראלי. עבור מחקרים שלנו, אנו מנסים רצף ~ 20 מיליון קורא לדגימה יש מספיק עומק לניתוח של וריאנטים גנומי הקשורים ויראלי וכן תכנים metagenomic 2,5. עבור מחקרים גילוי metagenomic ו הפתוגן, חשוב לציין כי זיהום DNA המארח הוא הוסר על ידי מערכת העיכול DNase. לכן נגיפים ופתוגנים אחרים המכילים הגנום DNA עלולים ללכת לאיבוד בתהליך, אולם ביניים RNA עשויים עדיין להיות רצף.
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).
96-Well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |