Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Несмотря на достигнутые успехи в понимании головы и шеи плоскоклеточный рак (ПРГШ) прогрессирования, частота пятилетняя выживаемость остается низкой из-за местных рецидивов и отдаленных метастазов. Одна из гипотез для объяснения этого рецидива является наличие раковых стволовых клеток типа (CSC), которые представляют присущую хемо- и радиорезистентности. В целях разработки новых терапевтических стратегий, необходимо иметь экспериментальные модели, которые проверки эффективности целевых методов лечения и, следовательно, иметь надежные методы для идентификации и выделения ЦОК. С этой целью мы приводим протокол для выделения ЦОК из линий человеческих клеток ПРГШ, которая опирается на комбинации двух последовательных сортировок клеток, выполненных с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS). Первый из них основан на свойстве ЦОК к сверхэкспрессии АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеру белков и, таким образом, исключить, среди других, жизненно важных красителей ДНК, такие как Hoechst 33342. Клетки отсортирован нногоявляется метод идентифицируются как "побочный населения" (СП). По мере того как SP клетки представляют собой низкий процент (<5%) родительских клеток, растущая фаза необходима для того, чтобы увеличить их число до второй сортировки клеток. Следующий шаг позволяет для отбора клеток , которые обладают двумя другими характеристиками ПРГШ стволовых клеток , то есть высокий уровень экспрессии маркера клеточной поверхности CD44 (CD44 высокий) и избыточная экспрессия альдегиддегидрогеназой (ALDH высокий). Так как использование одного маркера имеет многочисленные ограничения и подводные камни для изоляции ЦОНов, сочетание SP, CD44 и маркеры ALDH обеспечит полезный инструмент для выделения CSCs для дальнейших аналитических и функциональных анализов, требующих жизнеспособных клеток. Стволовые подобные характеристики ЦОК была окончательно подтверждена в пробирке формирования tumorispheres и экспрессии бета-катенина.
Голова и шея плоскоклеточный рак (ПРГШ) является распространенным злокачественным во всем мире и, несмотря на прогресс в современных методов лечения, у пациентов с прогрессирующим заболеванием имеют плохой прогноз. Общая 5-летняя выживаемость пациентов составляет около 30%, несмотря на сочетание терапевтических подходов, включая операции, химио-лучевой терапии и целевых-терапии. Недавние исследования объясняют местный рецидив и отдаленные метастазы для выживания раковых стволовых клеток типа (ОКК) после терапии противоопухолевыми 1. Существует накопления доказательств , подтверждающих существование клеток , представляющих стволовых клеток свойства (недифференцированные состояния, самообновлению и дифференцировке потенциала и активности теломеразы) в различных солидных опухолей , включая рак груди, мозга, простаты, легких, толстой кишки, поджелудочной железы, печени и кожи 2- 10. Тем не менее, происхождение ЦОК остается неясным 11,12. Они могут возникнуть в результате злокачественной трансформации нормальных стволовых клеток 3,13 или dedifferenференцирование опухолевых клеток , которые приобретают ОКК-подобные функции 14,15. Таким образом, понимание отличительных путей, связанных с ЦОК обеспечит понимание ранней диагностики и лечения резистентной ПРГШ.
Было высказано предположение , что ЦОК также обладают устойчивые фенотипы , которые уклоняются стандартной химиотерапии и лучевой терапии, что приводит к рецидиву опухоли по сравнению с основной массы опухолевых клеток и 16-19 локализованы в гипоксических ниши 20. Многочисленные факторы были предложены для объяснения этих сопротивлений ЦОК, такие как склонность к пассивности, усиливается репарации ДНК, повышающей регуляции механизмов контроля клеточного цикла, и свободных радикалов , поглощающие 21. Кроме того, несколько онкогенных молекулярные пути могут быть специфически активированы в ЦОК 17. В целях повышения знаний о ЦОК для дальнейших целенаправленных-терапии, нам нужны надежные методы для идентификации и выделения ЦОК, вследствие неоднородности маркеров стволовых клеток, связанных вразличные виды рака 22.
В ПРГШ, стволовой как опухолевые инициирующие клетки были выделены из первичных опухолей пациентов с помощью сортировки клеток , экспрессирующих различные биомаркеры КАН (такие как транспортеров выражение эффлюксного препарат 23, CD44, CD24 высокой низкой CD133 высокой, с-Met + фенотип 10,24, 25, или ALDH высокая активность 26) или культивирования первичной опухоли пациента с образованием squamospheres , которые имеют свойства CSC. Тем не менее, количество squamospheres резко уменьшается после двух пассажей, таким образом , давая небольшой размер выборки для дальнейшей характеристики исследования 27. Таким образом, в пробирке анализы , начиная от хорошо зарекомендовавших клеточных линий является простое решение для разработки экспериментов с целью улучшения знаний о ОКК.
Цель данной статьи состоит в том, чтобы предложить способ изолировать CSCs из линий ПРГШ клеток с использованием многопараметрической проточной цитометрии анализамй сортировки клеток. Выражение CD44 в корреляции с несколькими свойствами ОКК включая ALDH активности, со стороны населения (SP) фенотип, сфероид способность формирования и туморогенность используются, чтобы изолировать и охарактеризовать этот субпопуляции ЦОНов. CD44, клеточной поверхности гликопротеин, участвует в клеточной адгезии и миграции. CD44 экспрессируется на высоком уровне во многих солидных опухолях ЦОК 28, в том числе и в моделях рака головы и шеи 29-31. Кроме того, CD44 высокие клетки могут генерировать в естественных условиях гетерогенной опухоли , тогда как CD44 низкие клетки не могут 10. Анализ SP основана на дифференциальном потенциала клеток в оттоке красителя Hoechst 22 посредством семейства АТФ-связывающего кассетного (ABC) из белков – переносчиков избыточно экспрессируется в мембране CSC. Этот анализ включает в себя применение ингибиторов ABC-переносчиков, такие как верапамил в контрольных образцах. Альдегиддегидрогеназа (ALDH) является внутриклеточным ферментом, который участвует в превращении ретинол в РЭТinoic кислоты во время дифференцировки ранних стволовых клеток 25,26. Клетки , которые обладают высокой ALDH активность шоу стволовых клеток , как поведение в ПРГШ 26 и очень небольшое число ALDH высоких клеток способны генерировать опухоли в естественных условиях 26,32.
Сочетание этих маркеров и свойств был успешно использован Бертрана е т др. , Чтобы изучить сопротивление в пробирке и в естественных условиях этих ЦОК для фотонов и иона углерода излучения 19. Их результаты ясно показали, что сочетание различных маркеров и свойств клеток являются более селективными в отношении полезных исследований на популяции ПРГШ ОКК по сравнению с однократной маркерных подходов.
Этот протокол описывает надежный метод успешного выделения ЦОК от конкретной клеточной линии, которая применима к другим линиям ПРГШ клеток. Изолированные ОКК головы и шеи затем пригодны для дальнейшей молекулярной характеристики в пробирке и функциональной проверки путем тран…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |