Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Malgré les progrès dans la compréhension de la tête et du cou carcinomes épidermoïdes (CETC) progression, le taux de survie à cinq ans reste faible en raison de la récidive locale et des métastases à distance. Une hypothèse pour expliquer cette récurrence est la présence de cellules souches comme le cancer (CCM) qui présentent une chimio- inhérente et radio-résistance. Afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d'avoir des modèles expérimentaux qui valident l'efficacité des traitements ciblés et donc de disposer de méthodes fiables pour l'identification et l'isolement des CSC. A cette fin, nous présentons un protocole pour l'isolement des cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires humaines HNSCC qui repose sur la combinaison de deux tries successives de cellules réalisées par cellules activées par fluorescence (FACS). La première est basée sur la propriété de CSCs à surexpriment ATP-Binding Cassette (ABC) protéines de transport et donc exclure, entre autres, des colorants d'ADN vitaux tels que Hoechst 33342. Les cellules triées avec eest la méthode sont identifiés comme une «population de côté» (SP). Étant donné que les cellules SP représentent un pourcentage faible (<5%) des cellules parentales, une phase de croissance est nécessaire afin d'augmenter leur nombre avant le second tri cellulaire. L'étape suivante permet la sélection des cellules qui possèdent deux autres caractéristiques de cellules souches de CETC -à- dire de haut niveau du marqueur de surface cellulaire CD44 (CD44 haute) et la surexpression de l' aldéhyde déshydrogénase (ALDH haute) expression. Depuis l'utilisation d'un marqueur unique a de nombreuses limites et les pièges pour l'isolement des cellules souches cancéreuses, la combinaison de SP, CD44 et des marqueurs de l'ALDH fournira un outil utile pour isoler CSCs pour d'autres essais analytiques et fonctionnelles nécessitant des cellules viables. Les caractéristiques de souches comme des cellules souches cancéreuses a finalement été validés in vitro par la formation de tumorispheres et l'expression de β-caténine.
Tête et cou épidermoïde carcinome (CETC) est une tumeur maligne commune dans le monde entier et malgré les progrès réalisés dans les traitements actuels, les patients ayant une maladie avancée ont un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans globale du patient est d'environ 30%, malgré la combinaison d'approches thérapeutiques, y compris la chirurgie, chimio-radiothérapie et-thérapies ciblées. Des études récentes attribuent une récidive locale et de métastases à distance à la survie des cellules souches comme le cancer (CSC) suivant des thérapies anticancéreuses 1. Il y a accumulation de preuves étayant l'existence de cellules présentant des cellules souches propriétés (capacités état indifférencié, auto-renouvellement et de différenciation, et l' activité de la télomérase) dans diverses tumeurs solides , y compris du sein, du cerveau, de la prostate, du poumon, du côlon, du pancréas, du foie et de la peau 2- 10. Cependant, l'origine de CSCs reste incertaine 11,12. Ils peuvent résulter de la transformation maligne des cellules souches normales 3,13 ou dedifferenciation des cellules tumorales qui acquièrent des caractéristiques telles que CCM-14,15. Par conséquent, la compréhension des voies distinctes relatives à CSCs permettra de mieux comprendre le diagnostic et le traitement des CETC résistant tôt.
Il a été proposé que les cellules souches cancéreuses possèdent également des phénotypes résistants qui soustraient chimiothérapie et la radiothérapie classique, ce qui entraîne une rechute de la tumeur par rapport à la masse des cellules tumorales et 16-19 sont localisées dans des niches 20 hypoxique. De nombreux facteurs ont été proposés pour expliquer ces résistances de CSCS, tels que la propension à quiescence, amélioré la réparation de l' ADN, des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire régulés à la hausse, et de balayage des radicaux libres 21. En outre, plusieurs voies moléculaires oncogéniques peuvent être spécifiquement activées dans CSCs 17. Afin d'améliorer la connaissance des CSC pour-thérapies ciblées en outre, nous avons besoin de méthodes fiables pour l'identification et l'isolement des CSCs, en raison de l'hétérogénéité des marqueurs liés à des cellules souches dansdivers types de cancers 22.
En CETC, cellules souches , initiatrices de tumeurs ont été isolées à partir de tumeurs de patients primaire par le tri des cellules exprimant différents biomarqueurs du SCC (tels que la drogue efflux transporteurs expression 23, CD44 élevé, CD24 faible CD133 élevé, c-Met + phénotype 10,24, 25, ou ALDH haute activité 26) ou la culture de la tumeur primaire du patient pour former squamospheres qui ont des propriétés du SCC. Néanmoins, le nombre de squamospheres diminue considérablement après deux passages, donnant ainsi une petite taille de l' échantillon pour une caractérisation des études 27. Par conséquent, des essais in vitro à partir de lignées cellulaires bien établies est une solution plus facile à concevoir des expériences en vue d'améliorer la connaissance des CSC.
Le but de cet article est de proposer une méthode pour isoler CSCs de lignées de cellules HNSCC utilisant cytométrie de flux multiparamétrique analyse unnd tri cellulaire. L'expression de CD44 en corrélation avec plusieurs propriétés CCM y compris l'activité de ALDH, Side Population (SP) phénotype, la capacité de formation sphéroïde et tumorigénicité sont utilisés pour isoler et caractériser cette sous-population de CSCs. CD44 est une glycoprotéine de surface cellulaire, est impliquée dans l'adhésion cellulaire et la migration. CD44 est fortement exprimé dans de nombreuses tumeurs solides CSCs 28, y compris dans la tête et le cancer du col modèles 29-31. De plus, les cellules CD44 élevées peuvent générer in vivo d' une tumeur hétérogène alors que les cellules CD44 faibles ne peuvent pas 10. Le dosage de PS est basé sur le potentiel différentiel des cellules à efflux le colorant Hoechst 22 par l' intermédiaire de la famille ATP-binding cassette (ABC) , des protéines de transport surexprimés dans la membrane du SCC. Ce dosage comprend l'utilisation d'inhibiteurs de transporteurs ABC tels que le vérapamil dans les échantillons témoins. Aldéhyde déshydrogénase (ALDH) est une enzyme intracellulaire qui est impliqué dans la conversion du rétinol à retl' acide inoic lors de la différenciation des cellules souches début 25,26. Les cellules qui présentent une forte activité ALDH montrent le comportement des cellules souches comme dans HNSCC 26 et un très petit nombre de cellules élevées ALDH sont capables de générer des tumeurs in vivo 26,32.
La combinaison de ces marqueurs et des propriétés a été utilisé avec succès par Bertrand e t al. , Pour étudier la résistance in vitro et in vivo de ces cellules souches cancéreuses à un rayonnement de photons et 19 ions carbone. Leurs résultats ont clairement montré que la combinaison de différents marqueurs cellulaires et propriétés sont plus sélectifs pour les études utiles sur les populations HNSCC CCM que les approches mono-marqueurs.
Ce protocole décrit une méthode fiable pour l'isolement réussi de cellules souches cancéreuses à partir d'une lignée cellulaire spécifique qui est applicable à d'autres lignées de cellules HNSCC. Tête et du cou CSCs isolés sont ensuite appropriés pour une caractérisation moléculaire in vitro et la validation fonctionnelle par la transplantation chez des souris immunodéficientes 19. Cependant, certaines modifications peuvent être testés en fonction de la population de côt…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |