Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の進行の理解の進歩にもかかわらず、5年生存率は、局所的再発および遠隔転移に低いままです。この再発を説明するための1つの仮説は、固有の化学療法および放射線抵抗性を提示するがん幹細胞様細胞(CSCは)の存在です。新たな治療戦略を開発するためには、標的治療の有効性を検証する実験モデルを有し、したがって、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要です。この目的のために、我々は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって実行二つの連続するセルソーティングの組み合わせに依存しているヒトHNSCC細胞株からのCSCを単離するためのプロトコルを提示します。第1は、ヘキスト33342などの重要なDNA色素は細胞が目にソートし、ATP結合カセット(ABC)トランスポータータンパク質を過剰発現するため、除外し、他の人の間でするのCSCのプロパティに基づいていますこの方法は、「サイドポピュレーション」(SP)として識別されています。 SP細胞は親細胞の(<5%)低いパーセンテージを表すように、成長期には、第二の細胞選別の前にそれらの数を増加させるために必要です。次のステップは、他の二つのHNSCC幹細胞の特性は、細胞表面マーカーCD44( 高 CD44)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現(ALDH 高い )の高発現レベル、すなわち有する細胞の選択を可能にします。単一のマーカーの使用は、CSCを単離するための多数の制限および落とし穴を有するため、SP、CD44およびALDHマーカーの組み合わせは、生細胞を必要とするさらなる分析および機能的アッセイのためのCSCを単離するための有用なツールを提供します。 CSCの幹のような特性は、最終的にtumorispheresの形成とβカテニンの発現によりin vitroで検証しました。
頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、世界的に一般的な悪性腫瘍であり、現在の治療法の進歩にもかかわらず、進行した疾患を有する患者は予後不良です。患者の全体の5年生存率は、手術、化学療法、放射線療法及び標的 – 療法を含む治療法の組み合わせにもかかわらず、約30%です。最近の研究では、抗がん治療1次がん幹細胞様細胞(CSCは)の生存に局所再発および遠隔転移を属性。乳房、脳、前立腺、肺、結腸、膵臓、肝臓および皮膚2-含む種々の固形腫瘍における幹細胞の特性(未分化状態、自己再生および分化能力、およびテロメラーゼ活性)を提示する細胞の存在を支持する証拠が蓄積されています10。しかし、CSCをの起源は11,12不明のままです。これらは、正常な幹細胞3,13またはdedifferenの悪性転換から生じ得ますCSCのような機能14,15を獲得する腫瘍細胞のtiation。したがって、CSCをに関連する独特の経路を理解することは耐性HNSCCの早期診断と治療への洞察を提供します。
それのCSCはまた、腫瘍細胞のバルク16〜19と比較し、低酸素ニッチ20内に局在する腫瘍の再発を生じ、標準的な化学療法および放射線療法を回避耐性の表現型を有することが提案されています。多くの要因は、静止の傾向としてのCSCのこれらの抵抗、強化DNA修復、アップレギュレートされ、細胞周期制御機構、及びフリーラジカルスカベンジャー21を説明するために提案されています。また、いくつかの発癌分子経路は、具体的にCSCを17で活性化されてもよいです。さらにターゲット・治療のためのCSCの知識を向上させるために、我々は、中の幹細胞関連マーカーの不均一性のために、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要癌22の様々なタイプ。
HNSCCにおいて、幹様腫瘍開始細胞が、そのような薬物排出トランスポーターの発現23と異なるCSCバイオマーカー(CD44 高 、CD24 低 CD133 高 、のc-Met +表現型10,24を発現する細胞を選別することにより、一次患者の腫瘍から単離されています25、またはALDH 高活性26)またはCSC特性を有するsquamospheresを形成するために、主要な患者の腫瘍を栽培。それにもかかわらず、squamospheresの数は、このように、さらなる特徴付けのための小さなサンプルサイズが27を研究して与え、2継代後に劇的に減少します。したがって、十分に確立された細胞株から出発インビトロアッセイのCSCの知識を向上させるために実験を設計するための簡単なソリューションです。
この記事の目的は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー分析aを用いHNSCC細胞株からのCSCを単離するための方法を提案することですNDセルソーティング。 ALDH活性を含むいくつかのCSCの特性との相関におけるCD44の発現は、サイドポピュレーション(SP)の表現型、スフェロイド形成能と腫瘍形成を分離したCSCのこのサブ集団を特徴付けるために使用されます。 CD44、細胞表面糖タンパク質は、細胞接着および遊走に関与しています。 CD44は、高度に頭頸部癌モデル29-31を含め、CSCを28多くの固形腫瘍で発現されます。 CD44 low細胞が10できないのに対し、さらに、CD44 高細胞は、in vivo異種の腫瘍を発生させることができます。 SPアッセイは、CSC膜内で過剰発現トランスポータータンパク質のATP結合カセット(ABC)ファミリーを介しヘキスト色素22を流出する細胞の差電位に基づいています。このアッセイでは、対照試料中のベラパミルなどのABCトランスポーター阻害剤の使用を含みます。アルデヒド脱水素酵素(ALDH)は、RETにレチノールの変換に関与する細胞内酵素であります初期の幹細胞の分化25,26の間inoic酸。高いALDH活性ショーHNSCC 26における幹様細胞の挙動およびALDH 高い細胞の非常に少ない数を示す細胞は、 インビボ 26,32 に腫瘍を生成することができます。
これらのマーカーとプロパティの組み合わせが正常にベルトラン間tのアルで使用されていた。 インビトロ及び光子と炭素イオン照射19にこれらのCSCの生体内で抵抗を研究します。それらの結果は、様々な細胞マーカーおよび特性の組み合わせは、単一のマーカーのアプローチよりHNSCCのCSC集団に関する有用な研究のために、より選択的であることを示しました。
このプロトコルは、他のHNSCC細胞系にも適用可能である特定の細胞株からのCSCの成功を単離するための信頼できる方法を記載しています。孤立した頭と首のCSCは、その後、免疫不全マウス19内移植によるvitroおよび機能的検証のさらなる分子特性に適しています。しかし、いくつかの変更は、サイドポピュレーションまたは親細胞株中に存在するCD44 高 / ALDH 高…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |