Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Apesar dos avanços na compreensão da cabeça e pescoço progressão carcinomas de células escamosas (CECP), a taxa de sobrevivência de cinco anos permanece baixa devido à recorrência local e metástases à distância. Uma hipótese para explicar esta recorrência é a presença de câncer de células estaminais-like (CSCs) que apresentam quimioterapia inerente e radio-resistência. A fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas, é necessário dispor de modelos experimentais que validam a eficácia dos tratamentos específicos e, por conseguinte, dispor de métodos fiáveis para a identificação e isolamento das CSCs. Para este fim, é apresentado um protocolo para o isolamento de linhas CSCs de células de carcinoma epidermóide humano que assenta na combinação de duas células sucessivas ordenações realizadas por células activadas por fluorescência (FACS). O primeiro é baseado na propriedade de CSCs para superexpressão ATP de Ligação a cassete (ABC) proteínas transportadoras e, portanto, excluir, entre outros, corantes de ADN vitais como a Hoechst 33342. As células classificadas com thé método são identificados como um "side population" (SP). À medida que as células SP representa uma percentagem baixa (<5%) de células parentais, uma fase de crescimento é necessária, a fim de aumentar o seu número, antes da segunda separação de células. O próximo passo permite a selecção de células que possuem outras duas características de células estaminais HNSCC ie alto nível do marcador da superfície celular CD44 (CD44 alto) e o-expressão através de aldeído desidrogenase (ALDH alta) expressão. Uma vez que a utilização de um único marcador tem numerosas limitações e armadilhas para o isolamento de CSCs, a combinação de SP, CD44 e marcadores ALDH fornecerá uma ferramenta útil para isolar CSCs para mais ensaios analíticos e funcionais que necessitam de células viáveis. As características estaminais semelhante de CSCs finalmente foi validado in vitro pela formação de tumorispheres e a expressão de β-catenina.
carcinoma da cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é um tumor maligno comum em todo o mundo e apesar dos progressos em tratamentos atuais, os pacientes com doença avançada têm um mau prognóstico. A taxa de sobrevivência de cinco anos geral do paciente é de cerca de 30%, apesar da combinação de abordagens terapêuticas, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia-segmentados terapias. Estudos recentes atribuem recorrência local e metástases à distância para a sobrevivência de câncer de células estaminais-like (CSCs) após terapias anticâncer 1. Existem provas acumuladas de apoiar a existência de células que apresentam propriedades de células estaminais (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovação e diferenciação e actividade de telomerase) em diversos tumores sólidos incluindo cancro da mama, do cérebro, da próstata, do pulmão, do cólon, do pâncreas, do fígado e da pele 2- 10. No entanto, a origem de CSCs permanece obscuro 11,12. Eles podem resultar da transformação maligna de células-tronco normais 3,13 ou dedifferenciação de células tumorais que adquirem CSCs-como características 14,15. Portanto, a compreensão percursos distintos relacionados com CSCs irá fornecer informações sobre diagnóstico e tratamento de HNSCC resistentes cedo.
Tem sido proposto que os CSCs também possuem fenótipos resistentes que contornam a quimioterapia e radioterapia padrão, resultando em recidiva tumoral em comparação com a maior parte das células tumorais 16-19 e estão localizadas em nichos 20 hipóxico. Numerosos factores têm sido propostos para explicar estas resistências de CSCs, tais como a propensão para a quiescência, reparação melhorada de ADN, sobre-regulada mecanismos de controlo do ciclo celular, e de eliminação de radicais livres 21. Além disso, várias vias moleculares oncogénicos podem ser especificamente activado em CSCs 17. A fim de melhorar o conhecimento dos CSCs para-terapias-alvo ainda mais, precisamos de métodos confiáveis para a identificação e isolamento de CSCs, devido à heterogeneidade dos marcadores relacionados com células-tronco emvários tipos de cânceres 22.
Em HNSCC, caule-como células de iniciação do tumor foram isoladas a partir de tumores primários do paciente por células que expressam diferentes biomarcadores CSC (tais como transportadores de efluxo de drogas expressão 23, CD44 alto, CD24 low CD133 alta, c-Met + fenótipo 10,24 triagem, 25, ou uma elevada actividade de ALDH 26) ou cultivar tumor primário paciente para formar squamospheres que têm propriedades CSC. No entanto, o número de squamospheres diminui dramaticamente após duas passagens, proporcionando, assim, um pequeno tamanho de amostra para caracterização adicional 27 estuda. Portanto, ensaios in vitro a partir de linhas celulares bem estabelecidas é uma solução mais fácil para projetar experiências, a fim de melhorar o conhecimento dos CSCs.
O objetivo deste artigo é propor um método para isolar CSCs de linhas celulares CECP usando citometria de fluxo multiparamétrica análise de umnd separação de células. A expressão de CD44 em correlação com várias propriedades, incluindo a actividade de ALDH CSCs, lateral População (SP) fenótipo, a capacidade de formação de esferóides e tumorigenicidade são usados para isolar e caracterizar esta sub-população de CCC. CD44, uma glicoproteína de superfície celular, está envolvido na adesão celular e migração. CD44 é altamente expressa em muitos tumores sólidos CSCs 28, inclusive em modelos de câncer de cabeça e pescoço 29-31. Além disso, células de alta CD44 pode gerar in vivo um tumor heterogêneo enquanto que as células CD44 baixas não pode 10. O ensaio SP baseia-se na diferença de potencial das células ef luxar o corante Hoechst 22 através da família de cassete de ligação a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobre-expressas na membrana CSC. Este ensaio inclui o uso de inibidores de transportadores ABC tais como verapamil em amostras de controlo. Aldeído desidrogenase (ALDH) é uma enzima intracelular que está envolvido na conversão de retinol para retácido inoic durante a diferenciação de células-tronco cedo 25,26. As células que exibem um comportamento de alta ALDH atividade show de haste-como células em HNSCC 26 e um número muito poucos de células de alta ALDH são capazes de gerar tumores in vivo 26,32.
A combinação destes marcadores e propriedades foi utilizada com sucesso por Bertrand e t al., Para estudar a resistência in vitro e in vivo destes CSCs de fotões e de iões de carbono radiação 19. Os resultados mostraram claramente que a combinação de vários marcadores de células e propriedades são mais seletivos para estudos úteis sobre as populações HNSCC CSCs do que as abordagens-marcador único.
Este protocolo descreve um método de confiança para o isolamento bem sucedido de CSCs a partir de uma linha celular específica, que é aplicável a outras linhas de células de carcinoma epidermóide. CSCs de cabeça e pescoço isoladas são então adequado para posterior caracterização molecular in vitro e validação funcional por transplante em ratinhos imunodeficientes 19. No entanto, algumas modificações podem ser testados de acordo com a população CD44 lado ou os alta / ALDH…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |