Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 진행에 대한 이해의 진보에도 불구하고, 5 년 생존율 인해 국소 재발 및 원격 전이 낮은 유지된다. 이러한 재발을 설명하기위한 하나의 가설은 고유의 화학 치료 및 전파 저항을 제시 암 줄기 유사 세포 (CSC 추가)의 존재이다. 새로운 치료 전략을 개발하기 위하여, 표적 치료의 효과를 검증 실험 모델을 가지고 있으므로 된 CSC의 동정 및 분리를위한 신뢰성있는 방법이 필요하다. 이를 위해 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 수행되는 연속 된 두 셀 sortings (FACS)의 조합에 의존 HNSCC 인간 세포주에서 CSC 추가의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 첫 번째는 다른 사람의 사이에서 제외 따라서 카세트 (ABC) 트랜스 포터 단백질을 ATP가-바인딩 및 과발현하는 암줄 기세포의 특성을 기반으로, 같은 헥스 33342. 세포 같은 중요한 DNA 염료 번째로 정렬방법은 "측면 인구"(SP)로 식별됩니다. SP에 세포가 낮은 비율 부모 세포 (<5 %)을 나타내는 바와 같이, 성장 단계는 제 2 셀 정렬 전에 수를 증가시키기 위해 필요하다. 다음 단계는 두 HNSCC 줄기 세포 특성은 세포 표면 마커 CD44 (고 CD44) 및 알데히드 탈수소 효소의 과발현 (ALDH 높음)의 높은 발현 수준을, 즉 보유 세포의 선택을 허용한다. 단일 마커의 사용 된 CSC, SP의 조합의 분리 수많은 제한 및 함정을 갖기 때문에, CD44 및 ALDH 마커는 생존 세포를 필요로 상기 분석 및 기능 분석을위한 된 CSC를 분리하는 유용한 도구를 제공 할 것이다. 암줄 기세포의 줄기 같은 특성은 마지막으로 tumorispheres의 형성과 β-catenin의 발현에 의해 시험 관내에서 확인되었다.
머리와 목 편평 세포 암 (HNSCC)는 전 세계 공통의 악성 종양이며, 현재 치료의 발전에도 불구하고, 고급 질환 환자는 예후가있다. 환자의 전체 5 년 생존율은 수술, 화학 – 방사선 요법 – 및 대상을 포함한 치료 적 접근법의 조합에도 불구하고 약 30 %이다. 최근의 연구는 항암 치료 한 다음 암 줄기 같은 세포의 생존 (암줄 기세포)에 국소 재발과 원격 전이 때문이다. 유방, 뇌, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 간, 피부 2- 등 다양한 고형 종양 줄기 세포 특성 (미분화 상태,자가 재생과 분화 능력 및 텔로 머라 제 활성)을 제시 세포의 존재를지지 축적 증거가있다 10. 그러나, 암줄 기세포의 기원은 11, 12 불분명 남아 있습니다. 그들은 정상적인 줄기 세포 3,13 또는 dedifferen의 악성 변환으로 인해 발생할 수있는암줄 기세포와 같은 기능 14, 15를 취득 종양 세포의 tiation. 따라서 암줄 기세포에 관한 독특한 경로를 이해하는 것은 조기 진단과 저항 HNSCC의 치료에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.
된 CSC는 종양 세포 16-19의 부피에 비해 종양의 재발을 초래 표준 화학 요법과 방사선 치료를 회피 내성 표현형을 갖고, 20 틈새 저산소에 지역화 된 것이 제안되어왔다. 다양한 요소 그러한 정지 성향 등 CSC 추가의 저항이, 강화 된 DNA 수리, 상향 조절 세포주기 제어 메커니즘 및 자유 라디칼 소거능 (21)을 설명하기 위해 제안되었다. 또한, 여러 가지 종양의 분자 경로 구체적 된 CSC (17)에서 활성화 될 수있다. 또한 대상-치료를위한 암줄 기세포의 지식을 개선하기 위해, 우리는 줄기 세포 관련 마커의 이질성에 때문에, 식별 및 암줄 기세포의 분리를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다암 (22)의 다양한 종류.
HNSCC에서, 줄기 등을 종양 시작 세포와 같은 약물 유출 컨베이어 식 (23), CD44 높은, CD24 낮은 CD133 고, C-메트로 + 10, 24을 표현형으로 다른 CSC의 바이오 마커를 (발현하는 세포를 정렬하여 주 환자의 종양에서 고립 된, 25, 또는 ALDH 활성이 높은 26) 또는 CSC 속성이 squamospheres을 형성하는 주요 환자의 종양 양성. 그럼에도 squamospheres의 개수는 따라서 더 특성화 작은 샘플 크기 (27)을 연구주는 두 통로 후 급격히 감소한다. 따라서, 생체 외 분석이 잘 확립 된 세포주로부터 시작하는 CSC 추가의 기술을 개선하기 위해 실험을 설계하기 쉬운 해결책이다.
이 문서의 목적은 multiparametric 유세포 분석 A를 사용 HNSCC 세포주에서 암줄 기세포를 분리하는 방법을 제안하는 것이다차 셀 정렬. ALDH 활동 등 여러 암줄 기세포의 특성과의 상관 관계에서 CD44의 발현은, 사이드 인구 (SP) 표현형, 회전 타원체 형성 능력과 발암는 분리와 암줄 기세포의이 하위 집단의 특성을하는 데 사용됩니다. CD44, 세포 표면 당 단백질은 세포 부착 및 이동에 관여한다. CD44은 매우 머리와 목 암 모델 29-31에 포함 암줄 기세포 (28) 많은 고형 종양으로 표현된다. 또한, CD44 높은 세포는 10 수없는 생체 내에서 CD44 낮은 세포 반면, 이종 종양을 생성 할 수 있습니다. SP는 분석은 CSC 내에 과발현 막 수송 단백질의 ATP 결합 카세트 (ABC)를 통해 가정 훽스트 염료 22를 유출하는 세포의 미분 가능성에 기초한다. 이 분석은 대조 시료에서 베라파밀로 ABC 트랜스 포터 억제제의 사용을 포함한다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 마지막 ret 레티놀 변환에 관여하는 세포 내 효소초기 줄기 세포 분화 25, 26시 inoic 산. 높은 ALDH 활동 쇼 HNSCC (26)의 줄기와 같은 세포의 행동과 ALDH 높은 세포의 매우 적은 수를 나타내는 세포는 생체 내 26,32에 종양을 생성 할 수 있습니다.
이러한 마커 및 속성의 조합이 성공적으로 베르트랑 전자 t의 알에 의해 사용되었다. 시험관 내에서 광자하려면 다음 암줄 기세포의 생체 내 탄소 이온 방사선 (19)의 저항을 연구. 그들의 결과는 명확하게 다양한 세포 마커 및 속성의 조합이 단일 마커 방법보다 HNSCC 암줄 기세포 집단에 대한 유용한 연구를위한 더 선택적인 것으로 나타났다.
이 프로토콜은 다른 HNSCC 세포주에 적용되는 특정 세포주에서 CSC 추가의 성공적인 분리를위한 신뢰성있는 방법을 설명한다. 격리 된 머리와 목 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스 (19)에 이식하여 체외 및 기능 검증에 더 분자 특성화 다음에 적합하다. 그러나 일부 수정 측면 인구 또는 부모 세포주에 존재하는 CD44 고 / ALDH 높은 비율에 따라 테스트 할 수 있습니?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |