High Throughput<em> Danio rerio</em> Ensayo gasto energético
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
El pez cebra son un importante organismo modelo con ventajas inherentes que tienen el potencial de hacer que el pez cebra un modelo ampliamente aplicado para el estudio de la homeostasis energética y la obesidad. El pequeño tamaño del pez cebra permite ensayos con embriones que se llevan a cabo en un formato de placa de 96 o 384 pocillos, tecnologías basadas Morfolino y CRISPR promueven facilidad de manipulación genética, y el tratamiento de drogas mediante la aplicación del baño es viable. Por otra parte, el pez cebra son ideales para pantallas adelante genéticos que permitan la novela de descubrimiento de genes. Dada la relativa novedad del pez cebra como modelo para la obesidad, es necesario desarrollar herramientas que explotan plenamente estos beneficios. En este documento, se describe un método para medir el gasto de energía en miles de pez cebra embrionarias simultáneamente. Hemos desarrollado una plataforma de microplacas animal completamente en que utilizamos placas de 96 pocillos para aislar peces individuales y evaluar la producción acumulada NADH 2 mediante el cultivo de células viabilidad re disponible en el mercadoagente alamarBlue. En poiquilotermos la relación entre NADH 2 la producción y el gasto de energía está estrechamente vinculado. Este ensayo gasto de energía crea el potencial para cribar rápidamente manipulaciones farmacológicas o genéticas que alteran directamente el gasto de energía o alteran la respuesta a un fármaco aplicado (por ejemplo, sensibilizadores a la insulina).
Introduction
El ratón es actualmente el modelo predominante para la investigación de la obesidad. El intervalo generacional corto y herramientas genéticas disponibles en el ratón han sido sin igual hasta la fecha. Sin embargo, el pez cebra también tiene un intervalo de generación corto (3 – 4 meses) y supera incluso el ratón en la facilidad de manipulación genética 1,2. El pez cebra mantiene cerca del 90% de los genes de mamíferos, mientras que muy por encima del ratón en el número de para su uso en pantallas genéticas y drogas 3 potencial y descendencia.
Para aprovechar el potencial del modelo de pez cebra para el estudio de la obesidad, los ensayos deben ser desarrollados para investigar los factores que influyen en la regulación del peso corporal, incluyendo el gasto de energía. Como metabolitos se procesan a través de β-oxidación y el oxígeno ciclo de ácido tricarboxílico se consume NADH y 2 se produce. Por lo tanto, NADH 2 es un indicador directo del flujo de metabolitos a través de las vías metabólicas de oxidación (metabolito). En poikilotherms, H + a través de fugas de la membrana mitocondrial interna, que desacopla la oxidación de NADH 2 la síntesis de ATP, es 4 – 5 veces más baja que en homeotermos 4. En consecuencia, en el pez cebra NADH 2 está muy estrechamente vinculada a la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. En este documento, se describe un ensayo que mide NADH 2 la producción en larvas de pez cebra como un proxy para el gasto de energía 5.
El consumo de oxígeno es el estándar de oro para medir el gasto de energía. Sin embargo, para aprovechar al máximo el alto potencial de rendimiento del pez cebra, los ensayos de gasto de energía deben ser susceptibles de alto rendimiento. Sistemas de consumo de oxígeno que dependen de una cámara cerrada sistema de circulación están limitadas en el rendimiento por el número de cámaras disponibles 6. Abrir aire consumo de O 2 / CO 2 ensayos de producción también se han aplicado en el pez cebra 5,7. Estos al aire libre de 96 pocillos placa basesistemas d son susceptibles de alto rendimiento. Desafortunadamente, el intercambio de gases con el medio ambiente limita la sensibilidad de estos ensayos. Hemos publicado recientemente la aplicación de un ensayo que monitoriza NADH 2 utilizando el indicador redox alamarBlue 5. Este ensayo supera las limitaciones en el rendimiento y la sensibilidad común a los análisis de consumo de oxígeno en el pez cebra.
El pez cebra se está convirtiendo en un modelo cada vez más importante para el estudio de toda la homeostasis de la energía del cuerpo. En parte, porque el pez cebra son susceptibles de uso en pantallas adelante genéticos y las pantallas de drogas. Por otra parte, dirigida manipulación genética, incluyendo caída y knock-in, se puede aplicar rápidamente. Hemos demostrado anteriormente que este ensayo se puede combinar con la aplicación del fármaco bañera y desmontables genética o knockout para identificar compuestos y genes que alteran la tasa metabólica 5. Por otra parte, este ensayo está diseñado para explotar las ventajas de alto rendimiento inherentes al pez cebra. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
La contaminación con bacterias u hongos limitará en gran medida la aplicación de este ensayo. El azul de metileno en el medio embrión E3 limita la posibilidad de contaminación por hongos. A lo largo del embrión criando es fundamental que se tenga cuidado para eliminar embriones muertos dos veces al día. Además, es esencial para enjuagar bien los embriones con medio de embrión E3 estéril en el día de la iniciación del ensayo. Estos 2 pasos limitan el potencial para la contaminación bacteriana de los embrione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
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