Hochdurchsatz-<em> Danio rerio</em> Energieumsatz-Assay
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus mit inhärenten Vorteile, die das Potenzial Zebrafisch ein weithin angewandt Modell für die Untersuchung der Energie-Homöostase und Übergewicht zu machen. Die geringe Größe der Zebrafisch ermöglicht Tests an Embryonen in einem 96 oder 384 Well-Plattenformat durchgeführt werden, Morpholino und CRISPR basierte Technologien zu fördern einfache genetische Manipulation, und medikamentöse Behandlung von Badanwendung lebensfähig ist. Darüber hinaus sind Zebrafisch ideal für zukunfts genetischen Screens so dass für neues Gen Entdeckung. Angesichts der relativen Neuheit der Zebrafisch als Modell für Übergewicht, ist es notwendig, Werkzeuge, die diese Vorteile voll ausschöpfen zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Energieverbrauch in Tausenden von embryonalen Zebrafisch gleichzeitig zu messen. Wir haben eine ganze Tiermikroplattform, in der wir Platten mit 96 Vertiefungen zu einzelnen Fische zu isolieren entwickelt und wir beurteilen kumulative NADH 2-Produktion unter Verwendung des im Handel erhältlichen Zellkulturfähigkeit reMittel alamarBlue. In poikilotherms die Beziehung zwischen NADH 2 Produktion und Energieverbrauch ist eng verknüpft. Dieser Energieverbrauch Test schafft das Potenzial, sich rasch zu screenen pharmakologische oder genetische Manipulationen, die den Energieverbrauch direkt zu ändern oder ändern Sie die Reaktion auf eine angelegte Drogen (zB Insulin-Sensitizer).
Introduction
Die Maus ist derzeit das vorherrschende Modell für Adipositas-Forschung. Die kurze Generationsintervall und genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Maus wurden unerreicht auf dem Laufenden. Allerdings hat der Zebrafisch auch eine kurze Generationsintervall (3-4 Monate) und übertrifft sogar die Maus in eine einfache genetische Manipulation 1,2. Der Zebrafisch unterhält fast 90% der Säugetiergenen, während Sie die Maus weit über der Zahl der Nachkommen und das Potenzial für den Einsatz in genetischen und Drogen-Bildschirme 3.
Um das Potenzial des Zebrafisch-Modell für Studien der Fettleibigkeit zu erschließen, müssen Tests entwickelt werden, um Faktoren, die Gewichtsregulation, einschließlich Energieverbrauch beeinflussen zu untersuchen. Als Metaboliten werden durch β-Oxidation und Tricarbonsäurezyklus Sauerstoff verarbeitet verbraucht und NADH 2 wird erzeugt. Somit NADH 2 ist ein direkter Indikator des Flusses von Metaboliten durch Stoffwechselwege (Metabolit Oxidation). In poikilotherms, H + Leck durch die innere Mitochondrienmembran, die NADH 2 -Oxidation entkoppelt von der ATP-Synthese ist 4-5-fach geringer als bei Warmblütern 4. Dementsprechend wird in Zebrafisch NADH 2 sehr fest an die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung verknüpft. Hier beschreiben wir einen Test, der NADH 2 Produktion misst in Larven Zebrafisch als Proxy für den Energieverbrauch 5.
Der Sauerstoffverbrauch ist der Goldstandard zur Messung der Energieaufwand. Doch am besten nutzen Sie die Hochdurchsatz-Potenzial des Zebrafisch-Assays des Energieverbrauchs muss zugänglich für Hochdurchsatz sein. Sauerstoffverbrauch Systeme, die auf einer geschlossenen Kammer Umlaufsystem abhängt, werden im Durchsatz durch die Anzahl von Kammern vorhanden 6 begrenzt. Open-Air-O 2 Verbrauch / CO 2 -Produktion Assays wurden ebenfalls in der Zebrafisch 5,7 angewandt. Diese Open-Air-Platte mit 96 Vertiefungen BasisD Systems zugänglich sind hohem Durchsatz. Leider Gasaustausch mit der Umgebung begrenzt Empfindlichkeit dieser Assays. Wir haben vor kurzem veröffentlicht die Anwendung eines Assays, die NADH 2 Monitore mit dem Redoxindikator alamarBlue 5. Dieser Test überwindet die Beschränkungen in Durchsatz und Empfindlichkeit gemeinsam Analysen der Sauerstoffverbrauch in der Zebrafisch.
Der Zebrafisch ist ein zunehmend wichtiges Modell für die Untersuchung der ganze Körper Energie-Homöostase. Zum Teil, weil Zebrafisch zugänglich sind in den zukunfts genetischen Screens und Drogen-Bildschirme verwenden. Darüber hinaus gezielte genetische Manipulation, einschließlich Zuschlags und Knock-in, kann schnell angewendet werden. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Test kann mit Badewanne Medikamentenapplikation und der genetischen Zuschlags oder KO kombiniert werden, um Verbindungen und Gene, die Stoffwechselrate zu ändern 5 zu identifizieren. Außerdem ist dieser Test für die hohen Durchsatzvorteile inhärent Zebrabärbling auszunutzen. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontamination mit Bakterien oder Pilzen stark begrenzen Anwendung dieses Assays. Methylenblau in der E3-Embryomedium begrenzt die Möglichkeit einer Kontamination mit Pilzen. Im gesamten Embryo Aufzucht es wichtig, dass darauf geachtet wird, tote Embryonen zu entfernen zweimal täglich ist. Zusätzlich ist es wichtig, die Embryos mit sterilem E3 Embryo Medium gründlich am Tag Assayinitierungsbereich. Diese 2 Schritte begrenzen das Potenzial für bakterielle Kontamination der Embryonen. Die Einbeziehung der in Schritt 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
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