高スループット<em>ゼブラフィッシュ</em>エネルギー消費アッセイ
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュエネルギー恒常性と肥満の研究に広く適用モデルにする可能性を持っている固有の利点と重要なモデル生物です。ゼブラフィッシュの小さなサイズは、96または384ウェルプレート形式で実施される胚でのアッセイを可能にする、モルホリノ及びCRISPRベースの技術は、バス・アプリケーションによって遺伝子操作の容易性、および薬物治療を促進する実行可能です。また、ゼブラフィッシュは、新規遺伝子の発見を可能にし、前方の遺伝子スクリーニングに最適です。肥満のモデルとしてゼブラフィッシュの相対的新規性を考えると、それは完全にこれらの利点を活用するツールを開発することが必要です。ここで、我々は同時に、胚ゼブラフィッシュの数千にエネルギー消費を測定するための方法が記載されています。我々は個々の魚を隔離するために96ウェルプレートを使用した全動物のマイクロプレートプラットフォームを開発していると我々は、市販の細胞培養の生存率の再を使用して、累積NADH 2産生を評価しますエージェントアラマーブルー。 poikilothermsでNADH 2生産とエネルギー消費の関係が緊密にリンクされています。このエネルギー消費アッセイは急速に直接エネルギー消費を変更するか、適用された薬剤（例えば、インスリン増感剤）に対する応答を変化させる薬理学的または遺伝子操作をスクリーニングする可能性が作成されます。
Introduction
マウスは現在、肥満研究のための主要なモデルです。ショート発生間隔とマウスで利用可能な遺伝子ツールは、これまでに比類のないされています。しかし、ゼブラフィッシュも短く発生間隔があり（3から4ヶ月）と遺伝子操作1,2の容易さであっても、マウスを凌駕しています。これまでの遺伝子と薬剤スクリーニング3で使用するための子孫と潜在的な数でマウスを越えるとゼブラフィッシュは、哺乳動物遺伝子の約90％を維持しています。
肥満研究のためのゼブラフィッシュモデルの可能性をタップするには、アッセイは、エネルギー消費を含む体重調節に影響を与える要因を調査するために開発されなければなりません。代謝産物は、β酸化によって処理され、トリカルボン酸サイクルの酸素が 消費され、NADH 2が生成されます。このように、NADH 2は、代謝経路（代謝物の酸化）を介して、代謝物のフラックスの直接的な指標です。 poikilで恒温動物4に比べて5倍低い- otherms、H + ATP合成からNADH 2酸化を脱共役ミトコンドリア内膜、漏れるは、4です。したがって、2ゼブラフィッシュNADHには非常にしっかりと酸化的リン酸化を介してATP産生にリンクされています。ここで、我々は、エネルギー消費5のプロキシとして幼虫のゼブラフィッシュにおけるNADH 2産生を測定するアッセイを説明します。
酸素消費量は、エネルギー消費を測定するためのゴールドスタンダードです。しかし、最高のゼブラフィッシュの高スループットの可能性を活用するために、エネルギー消費のアッセイは、ハイスループットに従順でなければなりません。密閉チャンバー循環系に依存酸素消費システムは、利用可能なチャンバ6の数でスループットが制限されます。外気O 2消費量/ CO 2産生のアッセイはまた、ゼブラフィッシュ5,7に適用されています。これらのオープンエアの96ウェルプレートベースDシステムは、ハイスループットに適しています。残念ながら、環境とのガス交換は、これらのアッセイの感度を制限します。我々は最近、酸化還元指示薬アラマーブルー5を使用して、NADH 2をモニターするアッセイのアプリケーションを発表しました。このアッセイは、スループットおよびゼブラフィッシュにおける酸素消費量の分析に共通の感度の限界を克服します。
ゼブラフィッシュは、全身のエネルギー恒常性の研究のためにますます重要なモデルとなってきています。一部では、ゼブラフィッシュため、前方の遺伝子スクリーニングおよび薬物スクリーニングでの使用に適しています。また、ノックダウンとノックインを含む遺伝子操作を、ターゲットに、迅速に適用することができます。我々は以前に、このアッセイは、化合物および代謝率5を変更する遺伝子を同定するためにバス薬物適用および遺伝子ノックダウンまたはノックアウトと組み合わせることができることを示しています。さらに、このアッセイは、ゼブラフィッシュに固有の高スループットの利点を活用するように設計されています。 </P>
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌や真菌の混入が大幅にこのアッセイの適用を制限します。 E3胚培地中でメチレンブルーは、真菌汚染の可能性を制限します。胚全体に飼育ケアは毎日二度死んだ胚を除去するために取られることが重要です。加えて、徹底的に分析開始の日に、無菌のE3胚培地で胚を洗浄することが不可欠です。これらの2つのステップは、胚の細菌汚染の可能性を制限します。ステップ3.2に記載のブラン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
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