높은 처리량<em> 다니오 레 리오 (rerio)</em> 에너지 지출 분석
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
제브라 피쉬는 에너지 항상성 및 비만의 연구에 널리 적용 모델 만들 수있는 잠재력을 가지고 고유 이점 중요한 모델 생물이다. 배아에 대한 분석은 96 또는 384 웰 플레이트 형식으로 실시하는 제브라 피쉬의 작은 크기가 있습니다, 모르 폴리 노 및 CRISPR 기반 기술이 목욕 응용 프로그램에 의해 유전자 조작의 용이성 및 약물 치료를 촉진이 가능한 것입니다. 또한, 제브라 피쉬는 새로운 유전자 발견을 가능하게 앞으로 유전 화면에 이상적입니다. 비만 모델 지브라 피쉬의 상대적인 신규성을 고려할 때 이러한 장점을 충분히 활용 도구 개발하는 것이 필요하다. 여기서, 우리는 동시에 배아 지브라 피쉬 수천에서 에너지 소비를 측정하는 방법을 설명한다. 우리는 개별 물고기를 분리 96- 웰 플레이트를 사용하는 전체 동물 마이크로 플랫폼을 개발하고 우리는 시판되는 세포 배양 생존력 재를 사용하여 누적 NADH 2 생산을 평가에이전트 알라 마르 블루. poikilotherms 2에서 NADH의 생산 및 에너지 소비 간의 관계 단단히 연결되어있다. 이 에너지 소모 분석 급속 직접 에너지 소비를 변경 또는 응용 약물 (예, 인슐린 감작 제)에 대한 응답을 변경 또는 약리 유전 조작 화면까지의 전위를 생성한다.
Introduction
마우스는 현재 비만 연구를위한 지배적 인 모델이다. 짧은 세대 간격과 마우스에서 사용할 수있는 유전 적 도구는 현재까지 타의 추종을 불허하고있다. 그러나, 제브라 피쉬는 짧은 세대 간격이 (3-4개월를) 및 유전자 조작 1, 2의 용이성에서도 마우스를 능가한다. 먼 유전자 의약품 스크린 (3)에 사용하고 잠재적 자손의 수에 마우스를 초과하면서 지브라 피쉬는 포유 동물 유전자의 약 90 %를 유지한다.
비만 연구를위한 모델 지브라 피쉬의 전위 수돗물, 분석은 에너지 소비를 포함하여 체중 조절을, 영향 요인을 조사하기 위해 개발되어야한다. 대사 물질이 β 산화 및 트리 카르 복실 산 사이클의 산소를 통해 처리 될 때 소모되므로 NADH 2가 생성된다. 따라서, NADH 2는 대사 경로 (대사 산화)를 통해 대사 플럭스의 직접적인 지표이다. poikil에서homeotherms 4에 비해 5 배 낮은 – otherms, H는 +, ATP 합성에서 NADH 2 산화를 분리됩니다 4 미토콘드리아 내막을 통해 누출. 따라서, 제브라 피쉬 NADH 2는 매우 밀접하게 산화 적 인산화를 통해 ATP 생산에 연결되어 있습니다. 여기서, 우리는 에너지 소비 5 프록시로 애벌레 제브라 피쉬에서 NADH 2 생산을 측정하는 분석에 대해 설명합니다.
산소 소비는 에너지 소비를 측정하기위한 금 표준이다. 그러나, 가장 제브라 피쉬의 높은 처리량 잠재력을 활용하기 위해, 에너지 소비의 분석은 높은 처리량 의무가 있어야합니다. 순환 시스템 밀폐 챔버에 의존 산소 소비 시스템은 6 가능한 챔버들의 수로 처리량 제한된다. 야외 O (2) 소비는 / CO 2 생산 분석은 제브라 피쉬 5,7에 적용되었습니다. 이러한 야외 96 웰 플레이트베이스D 시스템은 높은 처리량 의무가 있습니다. 불행하게도, 환경과 가스 교환이 분석의 감도를 제한한다. 최근 우리는 레 독스 표시기 5 알라 마르 블루를 사용한 NADH 2를 모니터링 분석의 어플리케이션을 출판. 이 분석은 처리량 및 지브라 피쉬의 산소 소비량의 분석에 공통 감도 한계를 극복한다.
제브라 피쉬는 몸 전체의 에너지 항상성의 연구에 점점 더 중요한 모델이되고있다. 부분적으로, 제브라 피쉬 때문에 앞으로 유전 화면과 약물 화면에서 사용하는 의무가 있습니다. 또한, 최저 및 녹아웃에 신속하게 적용 할 수 있습니다 포함하여, 유전자 조작을 대상으로. 우리는 이전에이 분석은 화합물의 대사 속도를 변경할 5 유전자를 동정하기 위해 약물 목욕 애플리케이션 유전자 녹다운 또는 녹아웃과 조합 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 또한,이 분석은 제브라 피쉬에 내재 된 높은 처리량의 이점을 활용할 수 있도록 설계되었습니다. </P>
Protocol
Representative Results
Discussion
세균이나 곰팡이에 오염은 크게이 분석의 응용 프로그램을 제한합니다. E3 배아 매체 메틸렌 블루는 진균의 오염의 가능성을 제한한다. 배아 동안은 치료를 두 번 매일 죽은 태아를 제거하기 위해 수행하는 것이 중요 양육. 또한, 철저히 분석 개시 당일 멸균 E3 배아 매체 배아 린스하는 것이 필수적이다. 이러한 2 단계의 배아 박테리아 오염에 대한 잠재 성을 제한한다. 단계 3.2에서 설명한 빈 우물…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
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