High Throughput<em> Danio rerio</em> Dépense énergétique Assay
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
Poisson zèbre sont une importante organisme modèle avec des avantages inhérents qui ont le potentiel pour faire un poisson zèbre modèle largement appliqué pour l'étude de l'homéostasie énergétique et l'obésité. La petite taille du poisson zèbre permet des dosages sur les embryons soient menées dans un format de plaque à 96 ou 384 puits, les technologies basées Morpholino et CRISPR promouvoir la facilité de manipulation génétique, et de traitement de la toxicomanie par l'application de bain est viable. En outre, le poisson-zèbre sont idéales pour les écrans avant génétique permettant la découverte de nouveaux gènes. Compte tenu de la relative nouveauté de poisson zèbre comme un modèle pour l'obésité, il est nécessaire de développer des outils qui exploitent pleinement ces avantages. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer la dépense énergétique en milliers de poisson zèbre embryonnaire simultanément. Nous avons développé ensemble une plate-forme de microplaques animal dans lequel nous utilisons des plaques à 96 puits pour isoler chaque poisson et nous évaluer production cumulative NADH 2 à l'aide disponible dans le commerce culture cellulaire viabilité rel'agent alamarBlue. Dans poïkilothermes la relation entre NADH 2 production et la dépense d'énergie est étroitement liée. Cette analyse de la dépense d'énergie crée le potentiel pour cribler rapidement les manipulations génétiques ou pharmacologiques qui modifient directement des dépenses d'énergie ou modifient la réponse à un médicament appliquée (par exemple des sensibilisateurs à l'insuline).
Introduction
La souris est actuellement le modèle prédominant pour la recherche sur l'obésité. Le court intervalle de génération et des outils génétiques disponibles chez la souris ont été inégalée à ce jour. Cependant, le poisson zèbre a aussi un intervalle de génération court (3 – 4 mois) et dépasse même la souris dans la facilité de la manipulation génétique 1,2. Le poisson zèbre maintient près de 90% des gènes de mammifères, tout en dépassant de loin la souris dans nombre de descendants et le potentiel pour une utilisation dans les écrans génétiques et drogues 3.
Pour exploiter le potentiel du modèle de poisson zèbre pour les études à l'obésité, les dosages doivent être développées pour étudier les facteurs qui influencent la régulation du poids corporel, y compris les dépenses d'énergie. Comme métabolites sont traités par β-oxydation et l'oxygène du cycle de l'acide tricarboxylique est consommé et 2 NADH est produit. Ainsi, le NADH 2 est un indicateur direct du flux de métabolites par l'intermédiaire des voies métaboliques (oxydation) de métabolite. Dans poikilotherms, H + à travers la fuite la membrane mitochondriale interne, qui découple oxydation de NADH deux la synthèse d'ATP, est de 4 à 5 fois plus faible que dans les homéothermes 4. En conséquence, dans NADH poisson zèbre 2 est très étroitement liée à la production d'ATP par la phosphorylation oxydative. Ici, nous décrivons un essai qui mesure 2 NADH production larvaire chez le poisson zèbre comme un proxy pour les dépenses d'énergie 5.
La consommation d'oxygène est l'étalon-or pour mesurer la dépense énergétique. Pourtant, pour profiter au mieux du potentiel de débit élevé de poisson zèbre, les dosages de la dépense d'énergie doivent se prêter à haut débit. Des systèmes de consommation d'oxygène qui dépendent d'une chambre fermée système de circulation sont limitées en débit par le nombre de chambres disponibles 6. Ouvrir air consommation d'O 2 / CO 2 des essais de production ont également été appliqué dans le poisson zèbre 5,7. Ceux-ci en plein air de 96 puits de la plaque de baseD Systems se prêtent à haut débit. Malheureusement, les échanges gazeux avec l'environnement limite la sensibilité de ces tests. Nous avons récemment publié la demande d'un dosage qui surveille NADH 2 en utilisant l'indicateur d'oxydo-réduction alamarBlue 5. Ce dosage permet de surmonter les limitations de débit commun et de la sensibilité de l'analyse de la consommation d'oxygène dans le poisson zèbre.
Le poisson zèbre est en train de devenir un modèle de plus en plus important pour les études de l'homéostasie de l'énergie du corps. En partie parce que le poisson-zèbre se prêtent à utiliser dans les écrans génétiques à terme et de dépistage de drogues. En outre, la manipulation génétique ciblée, y compris effet de choc et knock-in, peuvent être appliquées rapidement. Nous avons précédemment montré que ce dosage peut être combiné avec l'application de la drogue bain et knock-down génétique ou knock-out pour identifier des composés qui modifient les gènes et les taux de 5 métabolique. En outre, ce dosage est conçu pour exploiter les avantages inhérents à haut débit pour le poisson zèbre. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
La contamination par des bactéries ou des champignons considérablement limiter l'application de cette analyse. Le bleu de méthylène dans le support d'embryon E3 limite la possibilité d'une contamination fongique. Tout au long de l'embryon cabrait il est essentiel que l'on prend soin de retirer les embryons morts deux fois par jour. En outre, il est indispensable de rincer abondamment les embryons avec le milieu d'embryon de E3 stérile sur le jour de l'analyse initiation. Ces 2 étapes d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
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