Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
РНК вирусологи, появление технологии рекомбинантной ДНК в конце 1970-х годов стало возможным преобразовать вирусной РНК геномы в кДНК-клонов, которые затем могут быть размножены в плазмид в бактерии для генетической манипуляции РНК-содержащих вирусов. 1 Первый РНК-вирус, чтобы быть молекулярно клонировали был бактериофага Qβ, положительно нити РНК вируса, который заражает кишечной палочки. Плазмиду, содержащую полную копию кДНК геномной РНК Qβ привело к инфекционным фагов Qβ, когда вводят его в Е. палочка. 2 Вскоре после этого, этот метод был применен к полиовируса, положительно нити РНК вируса человека и животных. Плазмида несущий полноразмерной кДНК полиовируса геномной РНК инфекционное при трансфекции в клетки млекопитающих и способны производить инфекционных вирионов 3 В этом "ДНК-запущен" подход, клонированные кДНК следует транскрипции внутри клетки, чтобы инициировать репликацию вируса РНК.Однако неясно, насколько транскрипция инициируется и как транскрипты обработаны для правильной последовательности вирусной. Эта проблема привела к развитию альтернативы "РНК-запущен" подход, при котором полная копия кДНК вирусного генома РНК клонируют под промотором распознается Е. палочка или РНК-полимераза фага для производства синтетических РНК в пробирке с определенной 5 'и 3' концах, которые подвергаются полный цикл репликации вируса при введении в клетки-хозяева. 4,5 Первый успех с этим подходом было сообщено для костра вируса мозаики , 6,7-положительная нить РНК вируса растений. С тех пор, РНК-запущен подход был разработан для широкого круга положительной цепь РНК вирусов, в том числе, калицивирусов альфавирусов, флавивирусов, arteriviruses и коронавирусов. 1,4,5,8
В обоих ДНК- и РНК-запустила систем обратного генетики, строительство FULL-кДНК клона является ключом к генерации инфекционного ДНК или РНК из положительной нити РНК-содержащих вирусов, но становится значительным технической задачей, так как размер вирусных геномных увеличивается. 9-17 В частности, большое РНК генома ~ 10 -32 кб представлены три основные препятствия на пути клонирования полноразмерной кДНК функциональной. 18 Первая трудность является синтез верный кДНК копировать, так как верность RT-PCR обратно пропорциональна длине вирусной РНК. Второе препятствие является наличие потенциально токсичных последовательностей, так как длинные молекулы РНК, скорее всего, содержит неожиданные последовательности, способные сделать фрагмент кДНК в плазмидах нестабильных в E. палочка. Третий и наиболее важным вопросом является наличие подходящего вектора, поскольку трудно найти клонирования вектор, который может доме вирусной кДНК вставку> 10 кб. За последние три десятилетия, эти барьеры были преодолены несколько достижений в энзимологии, методология, А.Н.д vectorology. 1,4,5,8 Из них наиболее перспективным и инновационное развитие является клонирование больших положительно цепь РНК вирусов, как инфекционных бактериальных хромосом (искусственные Бач). Вектор ВАС является низкой копию клонирование плазмиду (1-2 копий / клетку) на основе Е. палочка фактором фертильности, со средним размером вставки ДНК ~ 120-350 кб 19-21 Фрагмент ДНК встраивали в вектор BAC в аналогично клонирования в общих векторов клонирования. в результате ВАС клоны стабильно на протяжении многих поколений в E. палочка. 22,23 На сегодняшний день, технология ВАС были использованы для создания инфекционных клонов кДНК для> 10 членов трех положительно нити РНК вируса семей, т.е. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 и Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32
Использование японской энцефалита (Jev) в качестве примера, данная работа сообщает подробные процедуры, которые могут бытьиспользуется для построения стабильного генетически полнометражный инфекционного BAC для различных положительной нити РНК-вирусов. JEV является зоонозных флавивирус 33, который передается в природе между птицами, свиньями и другими позвоночных хозяев по комарами-переносчиками. 34,35 В людях, JEV инфекция может вызвать суровый часто роковую неврологические заболевания японский энцефалит (ЯЭ), 36 который происходит в Азия и части западной части Тихого океана, 37,38 по оценкам ежегодной заболеваемости ~ 50,000-175,000 клинических случаев. 39,40 В геноме JEV является ~ 11 т.п.н., одноцепочечной, положительным смысле молекулы РНК и состоит из один открытая рамка считывания (ORF), в окружении двух некодирующих областей (NCRs) на 5 'и 3' концы. 41,42 ОРС кодирует полипротеин, который расщепляется хостом и вирусных протеаз, чтобы генерировать 10 отдельных белков, обозначенный С PRM, Е, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 в N- к С-концевой направлении. 34,43,44 Кроме того, электроннаяXtended форма NS1 (NS1 ") выражается -1 рибосомальной frameshifting на кодонов 8-9 из NS2A. 45,46 Из этих 11 белков, три структурные белки (С, PRM и E) имеют важное значение для формирования инфекционного вирионы, 47,48 и остальные восемь неструктурные белки (NS1, чтобы NS5, и NS1 ") имеют решающее значение для репликации вируса РНК, сборку 49-51 частиц, 52-56 и врожденной уклонения иммунитета. 57-59 Оба 5'- и 3' "NCRs содержат сохраняется первичных последовательностей и форма РНК вторичных / третичных структур, 60-62, которые важны для модуляции вирусной репликации РНК. 63,64
Этот протокол описывает инструменты, методы и стратегии для создания полной длины инфекционное ВАС от JEV SA 14 -14-2. 28 Этот функциональный ВАС-клон содержит полную копию кДНК геномной РНК JEV, 65, который охватывается промоутер для SP6 РНК-полимеразы передвирусного 5'-конце и уникальный Xba I сайта рестрикции вниз по течению от вирусной 3'-конце для в пробирке стоки транскрипции. Эта технология ВАС применимо к построения полнофункциональной кДНК клона молекул для массива положительно нити РНК-вирусов.
В настоящее время протокол был успешно использован для создания полнометражных инфекционных клонов кДНК для двух различных штаммов (CNU / LP2 27 и SA 14 -14-2 28) JEV, в флавивируса, функциональная кДНК оказалась по сути трудно построить и распространяются из клетки-хозяина токсичности и генетической нестабильности клонированной кДНК 8,74-76 Этот протокол включает в себя три основных компонента:. первых, максимизации синтеза / амплификацию кДНК точную копию вирусной РНК с помощью высококачественного воспроизведения обратной транскриптазы / ДНК-полимераза; во-вторых, клонирование вирусной PRM-E кодирующую область, содержащую токсичные последовательности (неопубликованные данные) 74,77,78 в очень низкой копирования номер вектора BAC от начальной кДНК Субклонирование к конечным полнометражных этапов сборки кДНК; в-третьих, используя клонирующий вектор BAC, которые могут вместить чужеродной ДНК со средним размером 120-350 т.п.н., 19-21, по-видимому терпит больший INSE ДНКРТС, чем другие векторы для клонирования. Это клонирование подход широко применяться в многих других положительных нити РНК вирусов, особенно тех, с большим РНК генома ~ 10 до 32 кб. Генерация инфекционного клона кДНК является ключевым шагом в развитии системы обратного генетики для РНК-содержащих вирусов, особенно для положительных нити РНК-вирусов, потому что его геном выступает в качестве вирусной мРНК, которая транслируется в белков клетки-хозяина рибосом. Таким образом, вирусная репликация может быть инициировано путем введения кДНК, полученных генома длиной молекулы РНК в восприимчивого клетке-хозяине. Наличие инфекционного клона кДНК JEV, в сочетании с технологией рекомбинантной ДНК, возросла наше понимание различных аспектов жизненного цикла вируса на молекулярном уровне, такие как экспрессии генов 73,79 и геномной репликации. 63,64 Кроме того, полнометражный JEV клон кДНК оказалась ценным инструментом для развития антивирусных вакцин и векторов 28 доставки генов. <SUP> 80,81
Как и со всеми положительными нити РНК-содержащих вирусов, существует множество критических этапов построения надежного функционального кДНК JEV, из которого очень заразным РНК могут быть синтезированы в пробирке. В идеале, последовательности синтетической РНК транскрибируется с клона кДНК полной длины должны быть идентичны, что из геномной РНК вируса, в частности последовательностей 5'- и 3'-концевых которые необходимы для инициирования вирусной репликации РНК . 60-62 В текущем протоколе, подлинный 5'- и 3'-концы были обеспечены путем размещения последовательность SP6 промотора перед первым аденин нуклеотидов вирусного генома и позиционирование уникальный искусственный сайт рестрикции Xba I на выходе последнего тимин нуклеотидов вирусного генома, соответственно. Игрок национальной сборной синтетических РНК с подлинным 5 'и 3' концах были произведены стекания транскрипцию Xba I-линеаризованной и MBN обработанной кДНК тэmplate помощью SP6 РНК-полимеразы загрунтовать с м 7 г (5 ') PPP (5') колпачок аналог. Этот протокол может быть изменен несколькими способами. Для транскрипции в пробирке, другой бактериофага РНК-полимеразы (например, Т3 или Т7) может быть использован в сочетании с его четко определенной последовательностью промотора. 27 В стекания сайта, другой сайт рестрикции могут быть использованы, если его нет в вирусный геном, и если синтетические РНК из линеаризованной концов кДНК с аутентичным 3'-конце. Важность нуклеотидной последовательности 3'-концевого была продемонстрирована в ~ 10-кратному уменьшению РНК инфекционности при синтетической РНК содержит три или четыре вирусом связаны нуклеотидов на ее 3'-конце. 27 В пробирке реакции транскрипции в оба М 7 г (5 ') ррр (5') А и м 7 г (5 ') ррр (5') G Крышка аналогового может быть использован в равной степени, хотя последний местах неродственного дополнительное G нуклеотид перед вирусный 5 "-end, ноДобавление не изменяет инфекционность или репликации синтетической РНК. 27 Более того, удаление матрицы кДНК из РНК-транскриптов ДНКазой I пищеварения не является необходимым для РНК инфекционности испытаний, так как шаблон кДНК само по себе не инфекционное. 27
Технология ВАС в настоящее время применяется для построения инфекционных клонов кДНК для горстки положительно цепь РНК вирусов, а именно, двух Jevs, CNU / LP2 27 и SA 14 -14-2 28 (размер генома, ~ 11 Кб); два денге вирусы, БР / 90 26 и NGC 29 (~ 11 кб); вирус бычьей вирусной диареи, SD1 (~ 12 кб); 25 двухместных классических вирусов чумы свиней, C и Падерборн (~ 12 кб), 24 вирус пограничной болезни, Gifhorn (~ 12 кб), 24 свиной вирус репродуктивного и респираторного синдрома , PL97-1 / LP1 (~ 15 кб); 30 передающийся вирус гастроэнтерита, PUR46-MAD (~ 29 кб), 16 кошачий вирус инфекционного перитонита,DF-2 (~ 29 кб); 32 тяжелого острого респираторного синдрома коронавирус, Урбани (~ 30 кб); 9 респираторный синдром коронавируса Ближний Восток, EMC / 2012 (~ 30 кб); 17 и человека коронавирус, OC43 (~ 31 Кб) 31 Основным преимуществом использования БАС для строительства кДНК высокой генетической стабильности крупных, 1- или 2-копии плазмид ВАС. Однако, внутренняя природа его количества чрезвычайно низкой копирования также большим недостатком, из-за очень низких выходов ДНК ВАС и последующим снижением чистоты ДНК ВАС, в отношении хромосомной ДНК хозяина. В текущем протоколе, выход ВАС-ДНК максимизируется путем выращивания E. палочка DH10B трансформировали инфекционного BAC PBAC / SA 14 -14-2 в питательной среде, 2xYT. Несмотря на это усилий, средняя урожайность составляет всего ~ 15 мкг ВАС-ДНК из 500 мл бульона 2xYT. Кроме того, чистота ВАС-ДНК лучше всего достигается с помощью CsCl-EtBr центрифугирования в градиенте плотности для очисткиВместо обычно используемого столбца на основе выделения плазмид. Тем не менее, важно иметь в виду, что ВАС-трансформированную E. палочка не должны зарастать, потому что это может поставить под угрозу генетической стабильности клонированной кДНК, и более высокие темпы роста не обязательно приведет к повышению урожайности или BAC ДНК выше чистоты.
Протокол, описанный здесь, это оптимизированная, эффективный и рациональный способ построения и распространения генетически стабильной полнометражного инфекционное кДНК клона как BAC для JEV, процедура когда-то думали практически невозможно. Та же самая стратегия клонирования может быть применено ко многим другим положительным прядь РНК-вирусов. В целом, инфекционные кДНК-клоны позволяют ввести различные мутации (например, делеции, вставки, и точечные мутации) в вирусный геном РНК, чтобы изучить их биологические функции в репликации вируса и патогенеза. Это кДНК-система обратной генетики позволяет разрабатывать и ТЭСт вакцину и терапевтические кандидаты ориентирована на фактор (ы) вирулентности конкретного положительного нити РНК-вируса, представляющего интерес. Кроме того, эта технология инфекционное кДНК может быть также использован в качестве вирусного вектора, способного экспрессировать чужеродный ген (ы) интерес для многих приложений в биомедицинских исследований.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |