Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
لالفيروسات RNA، أدلى ظهور تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف في أواخر 1970s من الممكن تحويل الجينوم RNA الفيروسي إلى استنساخ كدنا]، والتي يمكن بعد ذلك نشرها كما البلازميدات في البكتيريا للتلاعب الجيني للفيروسات RNA. 1 فيروس RNA الأول أن يكون كان جزيئيا المستنسخة الجراثيم Qβ، فيروس RNA إيجابي المنطلق الذي يصيب القولونية. البلازميد التي تحتوي على نسخة كدنا] كاملة من الحمض النووي الريبي الجيني Qβ أدت إلى فاجات Qβ المعدية عندما أدخلت E. القولونية. 2 بعد ذلك بوقت قصير، تم تطبيق هذه التقنية لفيروس شلل الأطفال، وهو فيروس RNA إيجابي حبلا من البشر والحيوانات. تم المعدية عند transfected البلازميد تحمل كدنا] بالطول من الحمض النووي الريبي الجيني لفيروس شلل الأطفال في خلايا الثدييات وقادرة على انتاج virions المعدية 3 في هذا النهج "التي تطلق DNA"، يجب نسخها على cDNAs المستنسخة داخل الخلية لبدء النسخ المتماثل RNA الفيروسي؛ومع ذلك، فإنه من غير الواضح كيف يتم بدء النسخ وكيف تتم معالجة النصوص إلى تسلسل الفيروسي الصحيح. وقد أدى هذا الاهتمام إلى وضع بديل "تطلق RNA" النهج، حيث يتم استنساخ نسخة كدنا] كاملة من الجينوم الفيروسي RNA تحت المروج المعترف بها من قبل E. كولاي أو فج RNA البلمرة لإنتاج الرنا الاصطناعية في المختبر مع المعرفة 5 'و 3' تيرميني، التي تخضع لدورة تكاثر الفيروس كاملة عندما قدم إلى الخلايا المضيفة. 4،5 أفيد أول نجاح مع هذا النهج للبروم فيروس الفسيفساء ، 6،7 فيروس RNA إيجابي حبلا من النباتات. ومنذ ذلك الحين، تم وضع نهج أطلقت RNA لمجموعة واسعة من فيروسات RNA إيجابية المنطلق، بما في ذلك الكأسية (Caliciviruses)، alphaviruses، flaviviruses، arteriviruses، والفيروسات الإكليلية. 1،4،5،8
في كل من DNA- RNA وإطلاق أنظمة الوراثة العكسية، بناء القل طول كدنا] استنساخ هو المفتاح لتوليد الحمض النووي RNA المعدية أو من فيروسات RNA إيجابية المنطلق، ولكنه يصبح تحديا كبيرا الفني كما يزيد حجم الجينوم الفيروسي. 9-17 وعلى وجه الخصوص، الجينوم RNA كبير من ~ 10 -32 كيلوبايت تقدم ثلاث عقبات رئيسية في استنساخ [كدنا] وظيفي كامل طول. 18 وتكمن الصعوبة الأولى هي توليف [كدنا المؤمنين نسخ، لأن الإخلاص للRT-PCR يتناسب عكسيا مع طول RNA الفيروسي. العقبة الثانية هي وجود تسلسل السامة، لأن جزيئات الحمض النووي الريبي طويلة أكثر عرضة لتحتوي على تسلسلات غير متوقعة قادرة على صنع جزء كدنا] في البلازميدات غير المستقرة في E. القولونية. العدد الثالث والأكثر أهمية هو توافر ناقل مناسب، لأنه من الصعب العثور على ناقلات الاستنساخ الذي يتسع لادخال كدنا] الفيروسية> 10 كيلو بايت. على مدى العقود الثلاثة الماضية، وقد تم التغلب على هذه العقبات عن طريق العديد من التطورات في علم الإنزيمات، منهجية، وهيد vectorology. 1،4،5،8 ومن بين هؤلاء، وتطوير الواعدة والمبتكرة هي استنساخ كبيرة فيروسات RNA إيجابية حبلا الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية المعدية كما (البكالوريا). ناقلات BAC هو البلازميد-نسخة منخفضة الاستنساخ (1-2 نسخ / خلية) استنادا إلى E. عامل الخصوبة القولونية، ويبلغ متوسط حجم إدراج DNA من ~ 120-350 كيلوبايت 19-21 يتم إدخال جزء الحمض النووي في ناقلات BAC بطريقة مماثلة لاستنساخ في ناقلات الاستنساخ العامة؛ ينتج عن ذلك من الحيوانات المستنسخة BAC مستقرة على مدى عدة أجيال في E. القولونية. 22،23 وحتى الآن، وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لخلق BAC استنساخ [كدنا] المعدية ل> 10 أعضاء من ثلاث عائلات فيروس RNA إيجابية المنطلق، أي الفيروسات المصفرة، 24-29 Arteriviridae و 30 و Coronaviridae. 9،16،17 ، 31،32
باستخدام فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) كمثال، تقارير العمل الحالي الإجراءات التفصيلية التي يمكن أن تكونتستخدم لبناء كامل طول BAC المعدية مستقر وراثيا لمجموعة متنوعة من الفيروسات RNA إيجابية حبلا. JEV هو الفيروسة المصفرة الحيوانية 33 التي تم إرسالها في الطبيعة بين الطيور والخنازير، ويستضيف الفقاريات الآخرين من خلال البعوض الناقل. 34،35 في البشر، والعدوى JEV يمكن أن يسبب مرض عصبي التهاب الدماغ الياباني غالبا ما يكون مميتا شديد (JE)، 36 الذي يحدث في آسيا وأجزاء من غرب المحيط الهادئ، 37،38 مع حدوث سنوي يقدر ب ~ 50،000-175،000 الحالات السريرية. 39،40 الجينوم من JEV هو ~ 11 كيلو بايت، واحد الذين تقطعت بهم السبل،-بالمعنى الإيجابي جزيء RNA وتتكون من واحد إطار القراءة المفتوحة (ORF) يحيط بها اثنان مناطق غير الترميز (NCRS) في 5 'و 3' ينتهي. 41،42 وORF يشفر polyprotein التي المشقوق من قبل المضيف والبروتياز الفيروسية لتوليد 10 البروتينات الفردية، المعين C، PRM، E، NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5 في N- إلى الاتجاه C-المحطة. 34،43،44 أيضا، عن طريق البريدوأعرب عن شكل xtended من NS1 (NS1 ') من قبل -1 frameshifting الريباسي في الكودونات 8-9 من NS2A. 45،46 من هذه البروتينات 11، والبروتينات الهيكلية الثلاثة (C، PRM، وE) ضرورية لتشكيل المعدية virions، 47،48 وثمانية البروتينات غير الهيكلية المتبقية (NS1 إلى NS5، وNS1 ') هي الحاسمة لتكاثر الفيروس RNA، والتجمع 49-51 الجسيمات، 52-56 والفطري التهرب من الحصانة. 57-59 كل 5' و 3 'NCRS تحتوي يحفظ تسلسل الابتدائية و/ هياكل التعليم العالي شكل RNA الثانوية، 60-62 التي تعتبر هامة لتحوير تكرار RNA الفيروسي. 63،64
يصف هذا البروتوكول الأدوات والأساليب والاستراتيجيات لتوليد كامل طول BAC المعدية من JEV SA 14 -14-2. يحتوي على 28 استنساخ هذا BAC الوظيفي نسخة كدنا] كاملة من الحمض النووي الريبي الجيني JEV، 65 التي تشملها المروج لالبلمرة SP6 RNA المنبعمن الفيروسية 5'نهاية وفريدة من نوعها Xba I موقع تقييد المصب من الفيروسية 3'نهاية لفي المختبر الاعادة النسخ. هذه التكنولوجيا BAC قابلة للتطبيق على بناء كدنا] استنساخ الجزيئية تعمل بكامل طاقتها لمجموعة من الفيروسات RNA إيجابية حبلا.
وقد استخدم البروتوكول الحالي بنجاح لتوليد كامل طول استنساخ [كدنا] المعدية لمدة سلالات مختلفة (CNU / LP2 27 و SA 14 -14-2 28) من JEV، والفيروسة المصفرة التي كدنا] وظيفية وقد ثبت أن من الصعب أصلا لبناء و نشر بسبب سمية الخلية المضيفة وعدم الاستقرار الجيني للكدنا] المستنسخة 8،74-76 هذا البروتوكول يتضمن ثلاثة عناصر رئيسية هي: أولا، تحقيق أقصى قدر من تجميع / التضخيم من نسخة [كدنا المؤمنين من RNA الفيروسي باستخدام عالية الدقة عكس الناسخ / البلمرة DNA. ثانيا، استنساخ الفيروسية المنطقة PRM-E الترميز التي تحتوي على تسلسل السامة (بيانات غير منشورة) 74،77،78 في نسخ منخفضة جدا ناقلات عدد BAC من [كدنا الأولي subcloning لكامل طول الخطوات التجمع كدنا] النهائية؛ والثالث، وذلك باستخدام BAC ناقلات الاستنساخ التي يمكن أن تستوعب DNA الأجنبية بمتوسط حجم 120-350 كيلوبايت، 19-21 التي تتسامح مع ما يبدو أكبر INSE DNAالمحطة المذكورة من القيام ناقلات الاستنساخ الأخرى. وهذا النهج الاستنساخ تكون قابلة للتطبيق بشكل عام إلى العديد من الفيروسات RNA إيجابية حبلا الأخرى، لا سيما تلك التي لديها جينوم الحمض النووي الريبي كبير من ~ 10-32 كيلوبايت. جيل من استنساخ [كدنا] المعدية هو خطوة رئيسية في تطوير نظام الوراثة العكسية للفيروسات RNA، وخاصة بالنسبة للفيروسات RNA إيجابية المنطلق، لأن الجينوم الفيروسي يعمل مرنا كما أن تترجم إلى بروتينات التي ريبوسوم الخلية المضيفة. وبالتالي، يمكن أن يبدأ تكاثر الفيروس عن طريق إدخال الجينوم طول جزيء RNA المستمدة كدنا] إلى الخلية المضيفة عرضة للإصابة. إن وجود المعدية JEV كدنا] استنساخ، عندما جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، ازداد فهمنا لمختلف جوانب دورة حياة الفيروس على المستوى الجزيئي، مثل التعبير الجيني 73،79 وتكرار الجينوم. 63،64 أيضا، وقد أثبتت كامل طول JEV كدنا] استنساخ ليكون أداة قيمة لتطوير لقاحات مضادة للفيروسات 28 وناقلات توصيل الجينات. <سوب> 80،81
كما هو الحال مع جميع فيروسات RNA إيجابية المنطلق، هناك خطوات حاسمة متعددة في بناء كدنا] وظيفية يمكن الاعتماد عليها لJEV التي الرنا شديدة العدوى ويمكن تصنيعه في المختبر. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون تسلسل الرنا الاصطناعية كتب من نسخة من كامل طول كدنا] متطابقة إلى أن من RNA الجيني الفيروسي، وخاصة 5'- و3'-محطة متواليات المطلوبة لبدء النسخ RNA الفيروسي . 60-62 في البروتوكول الحالي، الحجية 5'- وتم ضمان 3'نهايات من خلال وضع تسلسل SP6 المروج المنبع من أول النوكليوتيدات الأدينين من الجينوم الفيروسي وتحديد المواقع على الاصطناعي Xba I موقع قيود فريدة من نوعها المصب من الماضي الثايمين النوكليوتيدات من الجينوم الفيروسي، على التوالي. توج الرنا الاصطناعية مع أصيلة 5 'و 3' ينتهي من إنتاج النسخ جولة الاعادة من Xba I خطي وMBN المعاملة [كدنا الشركة المصرية للاتصالاتmplate باستخدام SP6 RNA البلمرة معبي مع م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') قبعة التناظرية. يمكن تعديل هذا البروتوكول في عدة طرق. لنسخ في المختبر، وآخر بوليميريز RNA عاثية (على سبيل المثال، T3 أو T7) يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تسلسل المروج واضحة المعالم في 27 كموقع للجولة الاعادة، وهو موقع قيود مختلفة يمكن أن تستخدم إذا كان غير موجود في الجينوم الفيروسي RNA وإذا الاصطناعية من كدنا] خطي ينتهي مع 'نهاية 3 الأصيلة. وقد أثبتت أهمية تسلسل النوكليوتيدات 3'نهاية نقصان ~ 10 أضعاف في RNA العدوى عندما يحتوي RNA الاصطناعية ثلاثة أو أربعة النيوكليوتيدات الفيروسات لا علاقة لها في 'نهاية 3. 27 وفي النسخ في المختبر رد الفعل، على حد سواء م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') ألف وم 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') G غطاء التناظرية يمكن استخدامها على حد سواء بشكل جيد، على الرغم من أن الأماكن الأخيرة للا علاقة G النوكليوتيدات إضافية من المنبع الفيروسية 5 '-end، ولكن هذابالإضافة إلى ذلك لا يغير من العدوى أو تكرار RNA الاصطناعية. 27 وعلاوة على ذلك، وإزالة القالب كدنا] من النصوص التي كتبها RNA الدناز I الهضم ليست ضرورية لاجراء اختبارات الحمض النووي الريبي العدوى، لأن قالب [كدنا في حد ذاته ليس معديا. 27
وقد تم الآن تطبيق التكنولوجيا BAC لبناء استنساخ [كدنا] المعدية لحفنة من فيروسات RNA إيجابية حبلا، وهما، وهما JEVs، CNU / LP2 27 و SA 14 -14-2 28 (حجم الجينوم، ~ 11 كيلو بايت)؛ اثنين من فيروسات حمى الضنك، BR / 90 26 و NGC 29 (~ 11 كيلو بايت)؛ والبقري الفيروسي فيروس الإسهال، SD1 (~ 12 كيلو بايت) (25)؛ اثنان الكلاسيكية فيروسات حمى الخنازير، C وبادربورن (~ 12 كيلو بايت)؛ 24 فيروس مرض الحدود، جيفهورن (~ 12 كيلو بايت)؛ 24 فيروس متلازمة الجهاز التنفسي والتناسلي الخنازير ، PL97-1 / LP1 (~ 15 كيلو بايت) (30)؛ وفيروس التهاب المعدة والأمعاء انتقال، PUR46-MAD (~ 29 كيلو بايت) (16)؛ والقطط فيروس الصفاق المعدي،DF-2 (~ 29 كيلو بايت) (32)؛ وشديد التاجى المتلازمة التنفسية الحادة، أورباني (~ 30 كيلو بايت)؛ 9 الشرق الأوسط التنفسي متلازمة التاجى، EMC / 2012 (~ 30 كيلو بايت) (17)؛ والتاجى البشري، OC43 (~ 31 كيلوبايت) 31 والميزة الرئيسية لاستخدام البكالوريا لبناء كدنا] هو الاستقرار الجيني عالية من كبيرة، 1- أو 2-نسخة البلازميدات BAC؛ ومع ذلك، فإن الطبيعة الجوهرية للرقم ونسخة منخفضة للغاية لها هي أيضا عيب كبير، بسبب العائدات المنخفضة جدا من الحمض النووي BAC وما يترتب عليه من انخفاض في نقاء DNA BAC مع الاحترام لاستضافة DNA الكروموسومات. في البروتوكول الحالي، يتم تكبير العائد من BAC DNA من خلال زراعة E. القولونية DH10B تحولت مع BAC pBAC المعدية / SA 14 -14-2 في وسط الغنية بالمغذيات، 2xYT. وعلى الرغم من هذه الجهود، ومتوسط العائد هو فقط ~ 15 ميكروغرام من الحمض النووي BAC من 500 مل من مرق 2xYT. أيضا، فإن أفضل طريقة لتحقيق نقاء DNA BAC باستخدام CSCL-EtBr التدرج الكثافة الطرد المركزي لتنقيةبدلا من يشيع استخدامها على أساس العمود البلازميد العزلة. ومع ذلك، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن E.-تحولت BAC يجب القولونية لا كسا الأرض لأنه قد يعرض للخطر الاستقرار الجيني للكدنا] المستنسخة، ولا تؤدي زيادة النمو بالضرورة إلى زيادة الغلة أو DNA BAC-نقاء أعلى.
بروتوكول الموصوفة هنا هو والكفاءة، وطريقة مبسطة الأمثل لبناء ونشر مستقر وراثيا كامل طول كدنا] المعدية استنساخ باعتباره BAC لJEV، وهو إجراء يعتقد مرة واحدة مستحيلة عمليا. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الاستراتيجية استنساخ نفسها إلى العديد من الفيروسات RNA إيجابية حبلا أخرى. بشكل عام، استنساخ [كدنا] المعدية تمكننا من تقديم مجموعة متنوعة من الطفرات (على سبيل المثال، الحذف، الإدراج، والطفرات نقطة) في الجينوم الفيروسي RNA لدراسة الوظائف البيولوجية في تكاثر الفيروس والمرضية. هذا النظام الوراثة العكسية القائم على كدنا] يجعل من الممكن تطوير وقسم التدريب والامتحاناتلقاح ر والمرشحين العلاجية التي تستهدف عامل الفوعة (ق) من معين فيروس RNA إيجابية حبلا من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التكنولوجيا كدنا] المعدية كناقل الفيروسي، قادرة على التعبير عن جينات غريبة (ق) من الفائدة للعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |