Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
RNA 바이러스 학자를 들어, 1970 년대 후반에, 재조합 DNA 기술의 출현은 가능한 다음 RNA 바이러스의 유전 적 조작을위한 박테리아 플라스미드로 전파 될 수의 cDNA 클론 내로 바이러스 RNA 게놈을 변환했다. (1) 제 RNA 바이러스로 복제 분자는 박테리오파지 Qβ, 대장균 감염 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스이다. E.에 도입 할 때 Qβ 게놈 RNA의 전체 cDNA의 복사본을 포함하는 플라스미드 전염성 Qβ 파지 초래했다 대장균. (2) 그 후 곧,이 기술은, 소아마비 바이러스에인가 인간과 동물의 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스 하였다. 폴리오 바이러스 게놈 RNA의 전장 cDNA 베어링 플라스미드 감염성 포유 동물 세포 내로 형질 감염성 비리 온을 생성 할 때 3, 클로닝 된 cDNA는 바이러스 RNA 복제를 개시하는 세포 내에서 전사되어야이 "DNA 발사"접근 방식이다.;전사가 개시되는 방법과 증명서가 올바른 바이러스 서열에 어떻게 처리되는지 그러나 불분명하다. 이러한 문제는 다른 "RNA 발사"의 개발을 주도하고있다 접근법, 바이러스 RNA 게놈의 완전한 cDNA의 사본 E. 인식 프로모터 하에서 복제된다 숙주 세포 내로 도입 될 때 완전한 바이러스 복제 사이클을 겪는다 정의 5 '및 3'말단을 가진 시험관에서 합성 RNA를, 생산 용 대장균 또는 파아지 RNA 폴리머 라제.이 방식 제 성공 브롬 모자이크 바이러스에 대해보고 된 4,5- , 6,7- 식물의 양 가닥 RNA 바이러스. 그 후, RNA 발사 접근법 caliciviruses, alphaviruses, 플라 비 바이러스, arteriviruses 및 코로나 포함한 양성 가닥 RNA 바이러스의 광범위한 개발되었다. 1,4,5,8-
DNA- 및 모두에서, FUL의 구성을 역 유전학 시스템 RNA 발사~ 10 L – 길이의 cDNA 클론은 감염성 DNA 또는 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스의 RNA를 생성하는 키이지만 바이러스 게놈 크기가 증가 상당한 기술적 도전. 특히 9-17의 큰 RNA 게놈진다 -32 KB는 전신 기능의 cDNA 클로닝에 세 가지 주요 장애물을 제시한다. RT-PCR의 정확도는 바이러스 성 RNA의 길이에 반비례하므로 18 제 어려움 복사 충실한 cDNA를 합성한다. 긴 RNA 분자는 E. 불안정 플라스미드에서의 cDNA 단편을 제조 할 수있는 예기치 않은 서열을 포함 할 가능성이 있기 때문에 두번째 장애물은 잠재적으로 독성 서열의 존재이다 대장균. 이> 10 KB의 바이러스 cDNA를 삽입을 수용 할 수있는 클로닝 벡터를 발견하기 어렵 기 때문에 셋째, 가장 중요한 이슈는, 적당한 벡터의 유용성이다. 지난 3 년 동안,이 장벽은 효소 학, 방법론, 여러 진보에 의해 극복되었다D의 vectorology. 이들 중 1,4,5,8-는 가장 유망한 혁신 개발은 큰 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스 등 전염성 세균 인공 염색체 (BAC에)의 복제입니다. BAC 벡터는 E.에 기초하여 저 복사 클로닝 플라스미드 (1-2 복사 / 셀) 인 DNA의 평균 삽입 크기를 갖는 대장균 인자 불임, ~ 19-21 120-350 KB DNA 단편은 일반 클로닝 벡터로 클로닝에 유사한 방식으로 BAC 벡터에 삽입된다.; 결과 BAC 클론 E. 많은 세대에 걸쳐 안정적 대장균. 현재까지 22, 23는, BAC 기술은 즉 세 가지 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스 가족, 플라 비비 리다, 24 ~ 29 Arteriviridae, 30 Coronaviridae의> 10 명에 대한 감염의 cDNA 클론을 만드는 데 사용되었다. 9,16,17 , 31, 32
예를 들어 일본 뇌염 바이러스 (JEV)를 사용하여, 본 연구는 일 수 상세한 절차를보고양성 가닥 RNA 바이러스의 다양한 유전자 안정된 전장 감염성 BAC를 구성하는데 사용된다. 발생 JEV가, JEV 감염이 심한 종종 치명적인 신경 질환 일본 뇌염이 발생할 수 있습니다 인간에서 동물 매개 모기 벡터에 의해 조류, 돼지, 그리고 다른 척추 동물의 호스트 사이의 자연에서 전송 플라 비 바이러스 (33). (34, 35)입니다 (JE), (36) ~ 50,000-175,000 임상 경우의 예상 연간 발병률 아시아와 서태평양, 37, 38의 부품. 39, 40 JEV의 게놈 ~ 11 KB, 단일 가닥 긍정적 인 감지 RNA 분자이며 구성 5 '및 3'두 개의 비 코딩 영역 (의 NCR)에 의해 형벌 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 종료된다. 41, 42 ORF가 지정된 10 개별 단백질을 생성하는 호스트 및 바이러스 성 단백질 분해 효소에 의해 분해되는 폴리를 인코딩 C, PRM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 또한 C- 말단 방향에 N-있다. 34,43,44, 전자NS1 (NS1 ')의 xtended 양식 코돈 NS2A의 8-9에 의해 -1 리보솜 frameshifting 표현된다. 이들 11 단백질의 45, 46, 세 개의 구조 단백질 (C, PRM, E는) 감염의 형성에 필수적인 비리, 47, 48 및 나머지 8 비 구조 단백질 (NS5에 NS1 및 NS1 ')는 바이러스 성 RNA 복제, 49-51 입자 어셈블리, 52-56 및 선천성 면역 회피에 대한 중요하다. 57-59 모두 5'3 '의 NCR은 기본 시퀀스 및 바이러스 성 RNA 복제를 조절에 중요한 형태의 RNA 1 차 / 2 차 구조, 60-62을 보존 포함. 63, 64
이 프로토콜은 SA (14) -14-2 전체 길이 JEV의 감염 혈중 알코올 농도를 생성하기위한 도구, 방법 및 전략을 설명합니다. (28)이 기능 BAC 클론은 발기인에 포함되어 JEV 게놈 RNA의 전체 cDNA를 복사, (65)을 포함 SP6의 RNA 중합 효소에 대한 상향바이러스의 5'- 말단 및 체외 런 – 오프 전사 바이러스 3'- 말단의 하류 고유 XbaI으로 I 제한 사이트. 이 기술은 BAC 양성 가닥 RNA 바이러스의 배열에 대해 완전히 기능 분자의 cDNA 클론을 구축에 적용 할 수있다.
현재의 프로토콜은 성공적으로 두 개의 서로 다른 균주 (CNU / LP2 (27)와 사 (14) -14-2 28) JEV, 그 기능 cDNA를 입증했다 구축 할 본질적으로 어려울 수있는 플라 비 바이러스의과에 대한 전체 길이 감염의 cDNA 클론을 생성하는 데 사용 된 때문에 숙주 세포 독성 및 클로닝 된 cDNA의 유전 적 불안정성 전파 8,74-76을이 프로토콜은 세 개의 주요 구성 요소가 포함됩니다. 고성능 역 전사 효소를 사용하여 바이러스 RNA의 충실한의 cDNA 복사본의 합성 / 증폭을 최대화 먼저 / DNA 중합 효소; 둘째로, 마지막으로 전체 길이의 cDNA 조립 공정 초기에 서브 클로닝 된 cDNA로부터 매우 낮은 카피 수의 벡터에서 BAC (미발표 데이터) 서열을 함유하는 독성 바이러스 E-PRM 코딩 영역 74,77,78 클로닝; 그리고 세 번째, 분명히 더 큰 DNA의 INSE을 용인 120-350킬로바이트, 19-21의 평균 크기의 외래 DNA를 수용 할 수있는 클로닝 벡터의 혈중 알코올 농도를 이용하여보다 RTS는 다른 복제 벡터를 않습니다. 이 복제 방법은 다른 많은 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스, ~ 10 내지 32 KB의 큰 RNA 게놈을 가진 특히 일반적으로 적용 가능할 것이다. 게놈은 숙주 세포 변이가 단백질로 번역되는 바이러스 성 mRNA의 작용 때문에 감염성 cDNA를 클론의 발생은, 특히 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스에 대해, RNA 바이러스에 대한 역 유전학 시스템을 개발에서 중요한 단계이다. 따라서, 바이러스 복제는 감수성 숙주 세포에 유래하는 cDNA 게놈 길이의 RNA 분자의 도입에 의해 개시 될 수있다. 감염성 JEV의 cDNA 클론의 가용성 재조합 DNA 기술과 결합 될 때, 이러한 유전자 발현 73,79과 게놈 복제로서, 분자 수준에서 바이러스 생활주기의 다양한 양상의 이해를 증가 하였다. 63, 64이 또한, 전체 길이의 cDNA 클론 JEV 바이러스 백신은 28과 유전자 전달 벡터의 개발을위한 가치있는 도구임이 입증되었다. <SUP> 80, 81
모든 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스와 같이, 고도로 감염성 RNA를는 시험 관내에서 합성 될 수있는 JEV위한 안정적인 기능의 cDNA를 구축 여러 중요한 단계가있다. 이상적으로, 전체 길이의 cDNA 클론으로부터 전사 된 RNA를 합성의 순서는 바이러스 게놈 RNA 바이러스 RNA 복제의 개시에 필요한 특히 5'- 및 3'- 말단의 서열과 동일해야 . 60-62 현재 프로토콜에서, 인증 된 5'- 및 3'- 말단 마지막 하류를 바이러스 게놈의 제 아데닌 뉴클레오티드 상류의 SP6 프로모터 서열을 배치하고 고유 인공 XbaI으로 I 제한 부위의 위치에 의해 보장 된 각각 바이러스 게놈의 티민 염기. XbaI으로 I-선형화와 MBN 처리 cDNA를 TE의 결선 전사에 의해 생산 된 정통 5 '및 3'끝과 합성 RNA를 출장mplate M (7) G (5 ')를 준비하는 SP6 RNA 중합 효소 PPP (5') 캡 아날로그를 사용하여. 이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 그것은에없는 경우 시험 관내 전사를 들어, 다른 박테리오파지 RNA 폴리머 라제 (예, T3 또는 T7)이 그것의 잘 정의 된 프로모터 서열과 함께 사용될 수있다. (27)를 결선 부위로서, 다른 제한 사이트를 이용할 수있다 선형화 된 cDNA에서 바이러스 게놈과 경우 합성 RNA는 본격적인 3 '끝으로 끝납니다. 합성 RNA는 그 3 '말단에 서너 바이러스 무관 뉴클레오티드를 포함하는 경우 3'- 말단의 염기 서열의 중요성은 RNA 감염성의 ~ 10 배 감소에 의해 입증되었다. 시험 관내 전사 반응에 (27), 두 M (7) G (5 ') PPP (5')와 M (7) G (5 ') PPP (5') G 캡 아날로그 5 바이러스의 후반 장소하지만 관련이없는 여분의 G 염기 상류 잘 동일하게 사용할 수 있습니다 '-end하지만추가 감염 또는 합성 RNA의 복제를 변경하지 않습니다. (27) 또한, DNase의 I 소화에 의해 RNA 전 사체로부터의 cDNA 템플릿의 제거가 RNA의 감염 테스트를 위해 필요하지 않다 cDNA를 템플릿 자체는 감염되지 않기 때문에. (27)
BAC 기술은 이제 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스, 즉, 두 JEVs, CNU / LP2 (27)와 사 (14) -14-2 28 (게놈 크기, ~ 11킬로바이트)의 소수에 대한 감염의 cDNA 클론을 구성에 적용되었습니다; 두 뎅기열 바이러스, BR / 90 (26)와 NGC 29 (11 ~ KB); 소 바이러스 성 설사 바이러스, SD1 (12 ~ KB)을 25 개의 전형적인 돼지 열 바이러스, C 및 패더 (12 ~ KB) 24 국경 질환 바이러스, Gifhorn의 (12 ~ KB) 24 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 , PL97-1 / LP1 (15 ~ KB) 30 전염성 위장염 바이러스, PUR46 – MAD (~ 29킬로바이트) 16 고양이 전염성 복막염 바이러스,DF-2 (~ 29킬로바이트) 32 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스, 우르 바니 (30 ~ KB) 9 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스, EMC / 2012 (30 ~ KB), (17)과 인간 코로나 바이러스, OC43 (~ 31킬로바이트) 31의 cDNA 건설 BAC에 사용의 주요 이점은 대형, 1 또는 2 복사본 BAC 플라스미드의 유전 적 안정성이 높은 것이다.; 그러나, 극히 낮은 카피 수의 본질 때문에 BAC DNA의 염색체 DNA를 호스트에 대하여 BAC의 DNA의 순도가 감소 그에 매우 낮은 수율, 또한 큰 단점이다. 현재 프로토콜에서, BAC DNA의 수율은 E. 성장에 의해 극대화 대장균 DH10B는 영양이 풍부한 매체는 2xYT에 / 감염성 BAC의 PBAC와 SA (14) -14-2을 바꾸었다. 이러한 노력에도 불구하고, 평균 수율은 ~ 15 μg의는 2xYT 국물 500ml의에서 BAC의 DNA이다. 또한, BAC DNA의 순도는 정제를 위해 가장 CSCL-EtBr을 밀도 구배 원심 분리를 이용함으로써 달성된다오히려 일반적으로 사용되는 컬럼 기반의 플라스미드 분리보다. 그러나, 명심하는 것이 중요하다 BAC 변환 된 E. 이 복제 된 cDNA의 유전 적 안정성을 위태롭게 할 수 있기 때문에 대장균이 자라다하지 말아야하며, 더 높은 성장이 반드시 더 큰 수익률 또는 더 높은 순도의 BAC DNA로 이어질하지 않습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 JEV에 대한 BAC으로 유 전적으로 안정된 전체 길이 감염의 cDNA 클론의 건설 및 전파를위한 최적화, 효율적이며 능률적 인 방법, 절차는 한 번 실질적으로 불가능하다고 생각. 이 같은 클로닝 전략은 또한 다른 많은 양 가닥 RNA 바이러스에 적용될 수있다. 일반적으로, 감염의 cDNA 클론 바이러스 복제 및 병인에 생물학적 기능을 연구하는 바이러스 RNA 게놈에 돌연변이 (예를 들어, 삭제, 삽입, 및 점 돌연변이)의 다양성을 소개 할 수있게. 이 cDNA를 기반 역 유전학 시스템으로 개발할 수있게하고 TESt 백신 및 특정 관심 포지티브 – 가닥 RNA 바이러스의 병원성 인자 (들)를 치료 표적 후보. 또한, 이러한 감염성 cDNA의 기술은 또한 생물 의학 연구에 많은 응용 관심 외래 유전자 (들)을 발현 할 수있는 바이러스 벡터로 이용 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |