Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
Pour virologues d'ARN, l'avènement de la technologie de l'ADN recombinant dans les années 1970 a permis de convertir des génomes d'ARN viraux dans des clones d'ADNc, qui pourrait ensuite être propagées sous forme de plasmides dans des bactéries pour la manipulation génétique des virus à ARN. 1 Le premier virus à ARN soit clonage moléculaire était bactériophage Qß, un virus à ARN brin positif qui infecte Escherichia coli. Un plasmide contenant une copie complète de l'ADNc de l'ARN génomique Qß a donné lieu à des phages infectieux Qß lorsqu'il est introduit dans E. coli. 2 Peu de temps après, cette technique a été appliquée au poliovirus, un virus à ARN brin positif des humains et des animaux. Un plasmide portant un ADNc pleine longueur de l'ARN génomique du poliovirus a été infectieuse quand transfecté dans des cellules de mammifères et capable de produire des virions infectieux 3 Dans cette approche "de l'ADN-lancé", les ADNc clones devraient être transcrites intracellulaire pour lancer la réplication de l'ARN viral.cependant, il est difficile de savoir comment la transcription est initiée et la façon dont les transcriptions sont traitées à la séquence virale correcte. Cette préoccupation a conduit au développement d'une variante "ARN-lancé" approche, grâce à quoi une copie d'ADNc complète du génome de l'ARN viral est clone sous un promoteur reconnu par une E. coli ou de l'ARN polymérase du phage pour la production d'ARN de synthèse in vitro avec défini 5 'et 3', qui subissent le cycle complet de la réplication virale lorsqu'il est introduit dans des cellules hôtes. 4,5 Le premier succès avec cette approche a été signalé pour Brome virus de la mosaïque , 6,7 un virus à ARN brin positif de plantes. Depuis lors, l'approche de l'ARN lancé a été développé pour une large gamme de virus à ARN positif, y compris les calicivirus, les alphavirus, flavivirus, arterivirus et les coronavirus. 1,4,5,8
Dans les deux ADN et ARN lancé systèmes de génétique inverse, la construction d'un full-ADNc clone est la clé pour générer l'ADN infectieux ou d'ARN de virus à ARN à brin positif, mais il devient un véritable défi technique que la taille du génome viral augmente. 9-17 En particulier, un grand génome d'ARN de ~ 10 -32 kb présente trois obstacles majeurs à le clonage d'un ADNc fonctionnelle pleine longueur. 18 La première difficulté est la synthèse d'un ADNc fidèles copier, puisque la fidélité de RT-PCR est inversement proportionnelle à la longueur de l'ARN viral. Le second obstacle est la présence de séquences potentiellement toxiques, depuis de longues molécules d'ARN sont plus susceptibles de contenir des séquences imprévues capables de faire le fragment d'ADNc dans des plasmides instables dans E. coli. Le troisième et le plus important problème est la disponibilité d'un vecteur approprié, car il est difficile de trouver un vecteur de clonage qui peut loger un insert d'ADNc viral de> 10 kb. Au cours des trois dernières décennies, ces obstacles ont été surmontés par plusieurs avancées en enzymologie, la méthodologie, und vectorologie. 1,4,5,8 Parmi ceux-ci, le développement le plus prometteur et innovant est le clonage de grands virus à ARN brin positif chromosomes bactériens artificiels comme infectieuses (BAC). Le vecteur BAC est un plasmide à faible copie clonage (1-2 copies / cellule) en fonction du E. coli facteur de fertilité, avec une taille d'insert moyenne d'ADN de ~ 120 à 350 kb de 19 à 21 Un fragment d'ADN est inséré dans le vecteur BAC d'une manière similaire à clonage dans des vecteurs de clonage généraux. les clones BAC résultant sont stables depuis de nombreuses générations dans E. coli. 22,23 À ce jour, la technologie de BAC a été utilisé pour créer des clones d'ADNc infectieux pour> 10 membres de trois familles de virus à ARN brin positif, à savoir, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 et Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32
Utilisant le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) comme un exemple, le présent ouvrage présente les procédures détaillées qui peuvent êtreutilisé pour construire une pleine longueur BAC infectieuse génétiquement stable pour une variété de virus à ARN brin positif. JEV est un flavivirus zoonotique 33 qui est transmis dans la nature entre les oiseaux, les porcs, et d'autres hôtes vertébrés par les moustiques vecteurs. 34,35 Chez l'homme, l'infection peut provoquer le JEV grave souvent mortelle maladie neurologique encéphalite japonaise (EJ), 36 qui se produit dans Asie et certaines parties du Pacifique occidental, 37,38 avec une incidence annuelle estimée de ~ 50,000-175,000 cas cliniques. Le génome de 39,40 JEV est un ~ 11 kb, simple brin, molécule d'ARN de sens positif et se compose de un seul cadre de lecture ouvert (ORF) flanqué de deux régions non codantes (DND) aux extrémités 5 'et 3' se termine. 41,42 L'ORF code pour une polyprotéine qui est clivée par des protéases virales et hôte pour générer des 10 protéines individuelles, désigné C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5 dans la direction N- à C-terminale. De plus 34,43,44, eXtended forme de NS1 (NS1) est exprimée par -1 déphasage ribosomique au niveau des codons 8-9 de NS2A. 45,46 Sur ces 11 protéines, les trois protéines structurales (C, prM et E) sont indispensables pour la formation des maladies infectieuses 47,48 virions, et les huit autres protéines non structurales (NS1 à NS5, et NS1 ') sont essentiels pour la replication virale de l'ARN, l'assemblage de particules de 49 à 51, 52 à 56 et l'immunité innée évasion. 57-59 Les deux extrémités 5' et 3 «DND contiennent conservées séquences primaires et les structures sous forme d'ARN secondaire / tertiaire, 60-62 qui sont importants pour moduler la réplication de l'ARN viral. 63,64
Ce protocole décrit les outils, les méthodes et les stratégies pour générer une pleine longueur BAC infectieuse de JEV SA 14 -14 à 2. 28 Ce clone BAC fonctionnel contient une copie complète de l'ADNc de l'ARN génomique JEV, 65 qui est entouré par un promoteur pour l'ARN polymérase SP6 en amontde l'extrémité 5 'virale et un site de restriction Xba I unique, en aval de l'extrémité 3' virale pour la transcription in vitro de ruissellement. Cette technologie de BAC est applicable à la construction d'un clone moléculaire d'ADNc entièrement fonctionnelle pour un réseau de virus à ARN à brin positif.
Le protocole actuel a été utilisée avec succès pour générer de pleine longueur infectieux de clones d'ADNc de deux souches différentes (CNU / LP2 et 27 SA 14 -14 à 2 28) de JEV, un flavivirus dont ADNc fonctionnel est révélée être par nature difficiles à construire et propager en raison de la toxicité de la cellule hôte et de l'instabilité génétique de l'ADNc clone 8,74-76 Ce protocole comporte trois composantes majeures:. premières, en maximisant la synthèse / amplification d'une copie d'ADNc fidèles de l'ARN viral en utilisant inverse haute fidélité transcriptase / ADN polymérase; Deuxièmement, le clonage de la région virale prM-E de codage contenant des séquences toxiques (données non publiées) 74,77,78 dans un très faible nombre de copies vecteur BAC de l'ADNc initial sous-clonage aux pleine longueur étapes finales d'assemblage d'ADNc; et la troisième, en utilisant un taux d'alcoolémie de vecteur de clonage qui peut accueillir un ADN étranger avec une taille moyenne de 120 à 350 kb, 19-21 qui tolère apparemment plus grande ADN Inserts que les autres vecteurs de clonage. Cette approche de clonage sera généralement applicable à de nombreux autres virus à ARN à brin positif, en particulier ceux avec un grand génome ARN de ~ 10 à 32 kb. Génération d'un clone d'ADNc infectieux est une étape clé dans le développement d'un système de génétique inverse pour les virus à ARN, en particulier pour les virus à ARN à brin positif, parce que son génome agit ARNm viral qui est traduit en protéines par les ribosomes de la cellule hôte. Ainsi, la replication virale peut être initiée par l'introduction d'un génome de longueur molécule d'ARN dérivé de l'ADNc dans une cellule hôte sensible. La disponibilité d'un clone infectieux JEV ADNc, lorsqu'il est combiné avec la technologie de l'ADN recombinant, a permis de mieux comprendre les divers aspects du cycle de vie viral au niveau moléculaire, tel que l'expression du gène 73,79 et la replication du génome. 63,64 De plus, un pleine longueur JEV clone d'ADNc a prouvé être un outil précieux pour le développement de vaccins antiviraux 28 et des vecteurs de transfert de gènes. <sup> 80,81
Comme avec tous les virus à ARN à brin positif, il ya plusieurs étapes critiques dans la construction d'un ADNc fonctionnelle fiable pour JEV dont ARN hautement infectieux peuvent être synthétisés in vitro. Dans l'idéal, la séquence des ARN transcrits synthétiques partir d'un clone de l'ADNc pleine longueur doit être identique à celle de l'ARN génomique viral, en particulier les 5 'et 3'-terminales des séquences qui sont nécessaires pour l'initiation de la replication de l'ARN viral . 60-62 Dans le protocole courant, la 5 'et authentique extrémités 3' ont été assurées en plaçant la séquence promoteur SP6 en amont du premier nucléotide d'adénine du génome viral et le positionnement d'un site unique artificiel de restriction Xba I en aval du dernier thymine nucléotidique du génome viral, respectivement. Plafonné ARNs de synthèse avec l'authentique 5 'et 3' ont été produites par la transcription en run-off d'un ADNc te Xba I-linéarisé et MBN-traitémplate en utilisant l'ARN polymerase SP6 amorcée avec le G 7 m (5 ') ppp (5') un analogue de la coiffe. Ce protocole peut être modifié de plusieurs façons. Pour la transcription in vitro, un autre ARN bactériophage polymérase (par exemple, T3 ou T7) peut être utilisé en conjonction avec sa séquence de promoteur bien défini. 27 Comme un site run-off, un site de restriction différente peut être utilisée si elle ne figure pas dans le génome viral et l'ARN synthétique, si de l'ADNc avec les extrémités linéarisé authentique extrémité 3 '. L'importance de la séquence nucléotidique de l'extrémité 3 'a été mise en évidence par une diminution de ~ 10 fois de l'ARN infectieux quand un ARN synthétique contient trois ou quatre nucleotides des virus non lié à son extrémité 3'. 27 Dans un vitro réaction de transcription, à la fois la m 7 G (5 ') ppp (5') A et m 7 G (5 ') ppp (5') G bouchon analogique peut être utilisé aussi bien, bien que les derniers endroits d'un nucléotide G supplémentaire sans rapport amont de l'virale 5 "-end, mais queaddition ne modifie pas le pouvoir infectant ou de la réplication de l'ARN de synthèse. 27 En outre, l'enlèvement de la matrice d'ADNc à partir des transcrits d'ARN par la DNase I digestion est pas nécessaire pour les tests ARN infectieux, parce que la matrice d'ADNc lui-même ne sont pas infectieux. 27
La technologie d'alcoolémie a été appliquée à la construction de clones infectieux d'ADNc pour une poignée de virus à ARN brin positif, à savoir, deux JEVs, CNU / LP2 27 et SA 14 -14 à 2 28 (taille du génome, ~ 11 ko); deux virus de la dengue, BR / 90 26 et NGC 29 (~ 11 ko); le virus de la diarrhée virale bovine, SD1 (~ 12 kb); 25 deux classiques virus de la peste porcine, C et Paderborn (~ 12 kb); 24 le virus de la maladie de la frontière, Gifhorn (~ 12 kb); 24 le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb), 30 le virus de la gastroentérite transmissible, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 le virus de la péritonite infectieuse féline,DF-2 (~ 29 kb); 32 le coronavirus respiratoire aigu sévère de syndrome, Urbani (~ 30 kb); 9 du syndrome respiratoire coronavirus Moyen-Orient, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 et le coronavirus humain, OC43 (~ 31 kb) 31 Le principal avantage de l'utilisation des taux d'alcoolémie pour la construction d'ADNc est la grande stabilité génétique des grands, 1- ou 2-copie plasmides BAC.; Cependant, la nature intrinsèque de son nombre extrêmement faible copie est également un grand désavantage, en raison des très faibles rendements d'ADN BAC et la réduction conséquente de la pureté de l'ADN BAC à l'égard de l'ADN chromosomique hôte. Dans le protocole actuel, le rendement de l'ADN de BAC est maximisée par la croissance E. coli DH10B transformée avec le pBAC infectieuse BAC / SA 14 -14 à 2 dans un milieu riche en nutriments, 2xYT. Malgré cet effort, le rendement moyen est de seulement ~ 15 ug d'ADN BAC à partir de 500 ml de bouillon 2xYT. En outre, la pureté de l'ADN de BAC est mieux réalisée à l'aide de CsCl-EtBr centrifugation en gradient de densité de purification, Plutôt que le plasmide d'isolement utilisée en colonnes. Cependant, il est important de garder à l'esprit que le E. de BAC-transformé coli ne devrait pas proliférer parce que cela pourrait mettre en péril la stabilité génétique de l'ADNc clone, et la croissance plus élevé ne conduit pas nécessairement à des rendements plus élevés ou de l'ADN de BAC plus pureté.
Le protocole décrit ici est un optimisé, efficace et méthode simplifiée pour la construction et la propagation d'une pleine longueur d'ADNc clone infectieux génétiquement stable comme un taux d'alcoolémie pour le JEV, une procédure que l'on croyait pratiquement impossible. Cette même stratégie de clonage peut également être appliqué à de nombreux autres virus à ARN à brin positif. En général, les clones infectieux d'ADNc permettent d'introduire une variété de mutations (par exemple, des deletions, insertions et mutations ponctuelles) dans un génome d'ARN viral à l'étude de leurs fonctions biologiques dans la réplication virale et la pathogenèse. Ce système de génétique inverse à base d'ADNc permet de développer et de TESt vaccin et candidats thérapeutiques ciblant un facteur (s) de virulence d'un virus à ARN brin positif d'intérêt particulier. En outre, cette technologie infectieux d'ADNc peut également être utilisé comme un vecteur viral, capable d'exprimer un gène étranger (s) d'intérêt pour de nombreuses applications dans la recherche biomédicale.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |