Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
Para virologistas de ARN, o advento da tecnologia de DNA recombinante no final de 1970, foi possível converter os genomas virais de ARN em clones de ADNc, que pode então ser propagada como plasmídeos em bactérias para a manipulação genética de vírus de ARN. 1 O primeiro vírus de ARN ser molecularmente clonado foi Qp bacteriófago, um vírus de ARN de cadeia positiva que infecta Escherichia coli. Um plasmídeo contendo uma cópia de ADNc completa do ARN genómico Qp deu origem a Qp fagos infecciosos quando introduzido em E. coli. 2 Pouco tempo depois, esta técnica foi aplicada para poliovírus, um vírus de ARN de cadeia positiva de seres humanos e animais. Um plasmídeo que possui um ADNc de comprimento completo do ARN genómico poliovírus foi infecciosas quando transfectadas em células de mamífero e é capaz de produzir viriões infecciosos 3 Nesta abordagem "lançou-ADN", os ADNc clonados deve ser transcrita intracelularmente para iniciar a replicação do ARN virai.;no entanto, não está claro como a transcrição é iniciada e como as transcrições são transformados com a sequência correcta viral. Esta preocupação tem levado ao desenvolvimento de uma alternativa "lançou-ARN" abordagem, em que uma cópia de cDNA do genoma completo de RNA viral é clonado sob um promotor reconhecido por uma E. coli ou ARN polimerase do fago para a produção de ARN sintéticos in vitro com definido 5 'e 3', que se submetem a um ciclo completo de replicação virai quando introduzidos em células hospedeiras. 4,5 O primeiro sucesso com esta abordagem foi relatado para brome vírus do mosaico , 6,7 um vírus de ARN de cadeia positiva de plantas. Desde então, a abordagem lançada ARN foi desenvolvido para uma grande variedade de vírus de ARN de cadeia positiva, incluindo calicivírus, alfavírus, flavivírus, coronavírus, e arteriv�us. 1,4,5,8
Em ambos o ADN e ARN-lançado sistemas de genética inversa, a construção de um full-clone de ADNc de comprimento é a chave para a geração de ADN ou ARN infecciosos de vus de ARN de cadeia positiva, mas torna-se um considerável desafio técnico, conforme o tamanho do genoma viral aumenta. 9-17 Em particular, um grande genoma de ARN de ~ 10 -32 kb apresenta três principais obstáculos para a clonagem de um ADNc de comprimento completo funcional. 18 A primeira dificuldade é a síntese de um cDNA cópia fiel, uma vez que a fidelidade da RT-PCR é inversamente proporcional ao comprimento do RNA viral. O segundo obstáculo é a presença de sequências potencialmente tóxicos, uma vez que as moléculas de RNA longas são mais prováveis de conter sequências inesperadas capazes de fazer o fragmento de cDNA em plasmídeos instáveis em E. coli. O terceiro e mais importante causa é a disponibilidade de um vector adequado, uma vez que é difícil encontrar um vector de clonagem que pode alojar um inserto de cDNA viral de> 10 kb. Ao longo das últimas três décadas, essas barreiras foram superadas por vários avanços na enzimologia, metodologia, umad vectorology. 1,4,5,8 Destes, o desenvolvimento mais promissor e inovador é a clonagem de grandes vírus de ARN de cadeia positiva cromossomas artificiais bacterianos (BACs como infecciosas). O vector BAC é um plasmídeo de baixo número de cópias de clonagem (1-2 cópias / célula), com base na E. coli factor de fertilidade, com um tamanho médio de inserção de ADN de 19-21 kb ~ 120-350 Um fragmento de DNA é inserida no vector BAC de uma forma semelhante à clonagem em vectores de clonagem gerais.; os clones BAC resultantes são estáveis ao longo de muitas gerações, em E. coli. 22,23 Até à data, a tecnologia BAC foi usado para criar clones de ADNc infecciosos para> 10 membros de três famílias de vírus ARN de cadeia positiva, isto é, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 e Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32
Usando vírus da encefalite japonesa (JEV) como um exemplo, o presente trabalho relata os procedimentos detalhados que podem serutilizado para construir um de comprimento completo de BAC infeccioso geneticamente estável para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva. JEV é um flavivírus zoonótica 33 que é transmitida em natureza entre aves, porcos e outros hospedeiros vertebrados por vectores de mosquito. 34,35 Nos seres humanos, a infecção pode causar o JEV grave doença neurológica encefalite japonesa frequentemente fatal (JE), 36 que ocorre na Ásia e partes do Pacífico Ocidental, 37,38 com uma incidência anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. 39,40 O genoma do JEV é uma ~ 11 kb,, molécula de RNA de cadeia simples de sentido positivo e consiste em uma única estrutura de leitura aberta (ORF) flanqueada por duas regiões não codificantes (NCRs) nas extremidades 5 'e 3'. A ORF codifica 41,42 uma poliproteína que é clivada por proteases do hospedeiro e virais para produzir as proteínas individuais 10, designado C, prM, E, NS1, NS2a, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 na direcção N- para C-terminal. 34,43,44 Além disso, uma mensagemXtended forma de NS1 (NS1 ") é expresso por -1 frameshifting ribossomal nos codões 8-9 da NS2a. 45,46 Destes 11 proteínas, as três proteínas estruturais (C, prM e E) são essenciais para a formação de infeccioso viriões, 47,48 e os restantes oito proteínas não estruturais (NS1 a NS5, e NS1 "), são essenciais para a replicação viral de ARN, a montagem de partícula 49-51, 52-56 e 57-59 a imunidade inata evasão. Tanto a 5 'e 3 'NCRs contêm sequências conservadas estruturas primárias e secundárias de ARN forma terciária / 60-62, que são importantes para modular a replicação do ARN virai 63,64.
Este protocolo descreve as ferramentas, métodos e estratégias para a geração de um de comprimento completo de BAC infeccioso do JEV SA 14 -14-2. 28 Este clone de BAC funcional contém uma cópia de cDNA completa do ARN genómico JEV, 65, que é abarcado por um promotor para a polimerase de ARN de SP6 a montantedo vírus da extremidade 5 'e um local de restrição Xbal único a jusante da extremidade 3' viral para a transcrição in vitro run-off. Esta tecnologia BAC é aplicável à construção de um clone molecular de cDNA totalmente funcional para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva.
O protocolo corrente foi utilizado com sucesso para gerar full-length clones de ADNc infecciosos de duas estirpes diferentes (CNU / LP2 27 e 14 SA -14-2 28) do JEV, um flavivírus cujo ADNc funcional demonstrou ser inerentemente difícil de construir e propagar por causa da toxicidade da célula hospedeira e a instabilidade genética do ADNc clonado 8,74-76 Este protocolo envolve três componentes principais:. em primeiro lugar, maximizando a síntese / amplificação de uma cópia fiel ADNc do ARN viral de alta fidelidade utilizando transcriptase reversa / ADN-polimerase; Em segundo lugar, a clonagem da região prM-E viral contendo sequências de codificação tóxicos (dados não publicados) 74,77,78 em um nível muito baixo número de cópias do vector BAC de cDNA inicial de subclonagem para os passos de comprimento completo de ADNc de montagem final; e em terceiro lugar, utilizando um vector de clonagem BAC que pode acomodar um ADN estranho com uma dimensão média de 120-350 kb, que, aparentemente, 19-21 tolera maiores ADN InSerts do que os outros vectores de clonagem. Esta abordagem de clonagem será geralmente aplicável a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva, particularmente aqueles com um grande genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Geração de um ADNc de clone infeccioso é um passo chave no desenvolvimento de um sistema de genética inversa de vírus de ARN, especialmente para vírus de ARN de cadeia positiva, porque o seu genoma actua como ARNm viral que é traduzido em proteínas por ribossomas da célula hospedeira. Assim, a replicação virai pode ser iniciada pela introdução de um genoma de comprimento molécula de ARN derivado de ADNc numa célula hospedeiro susceptível. A disponibilidade de um clone infeccioso de cDNA JEV, quando combinado com a tecnologia de ADN recombinante, tem aumentado a compreensão dos vários aspectos do ciclo de vida virai, a nível molecular, tais como a expressão de genes e replicação do genoma 73,79. 63,64 Além disso, uma de comprimento completo JEV clone de ADNc tem provado ser uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de vacinas antivirais 28 e vectores de entrega de genes. <sup> 80,81
Tal como acontece com todos os vírus de ARN de cadeia positiva, existem vários passos críticos na construção de um ADNc funcional de confiança para o JEV a partir do qual os ARN altamente infecciosas podem ser sintetizados in vitro. Idealmente, a sequência dos ARN transcritos sintéticos a partir de um clone do ADNc de comprimento completo deve ser idêntico ao do ARN genómico viral, particularmente os 5'- e 3'-terminal de sequências que são necessárias para a iniciação da replicação de ARN viral . 60-62 No protocolo actual, o autêntico 5'- e 3'- extremidades foram assegurada colocando a sequência de promotor SP6 a montante do primeiro nucleótido adenina do genoma viral e o posicionamento de um local de restrição único artificial Xbal a jusante do último timina nucleótidos do genoma virai, respectivamente. Tampado RNAs sintéticos com o autêntico 5 'e 3' foram produzidos por transcrição de um Xba I-linearizado e tratou-MBN cDNA te run-offmplate utilizando polimerase SP6 ARN preparado com o m 7 G (5 ') ppp (5') Um análogo de tampão. Este protocolo pode ser modificado de várias maneiras. Para transcrição in vitro, uma outra polimerase de ARN do bacteriófago (por exemplo, T3 ou T7) pode ser utilizado em conjunto com a sua sequência promotora bem definida. 27 Como um local de escoamento, um local de restrição diferente pode ser utilizada se não está presente em do genoma viral e de ARN sintética se a partir do ADNc linearizado termina com o autêntico extremidade 3 '. A importância da sequência de nucleótidos da extremidade 3 'foi demonstrado por uma diminuição ~ 10 vezes na infectividade de ARN, quando uma ARN sintético contém três ou quatro nucleótidos de vírus não relacionados, na sua extremidade 3'. 27 Em uma reacção de transcrição in vitro, tanto o m 7 G (5 ') ppp (5') A e m 7 G (5 ') ppp (5') G tampa analógico podem ser utilizados igualmente bem, embora o último lugares um não relacionado nucleótido G adicional a montante do viral 5 '-end, mas issodisso não altera a capacidade de infecção ou replicação de RNA sintético. 27 Além disso, a remoção do molde de ADNc a partir dos transcritos de ARN por digestão com DNase I não é necessário para testes de ARN de infecciosidade, porque o modelo de cDNA em si não é infecciosa. 27
A tecnologia BAC foi agora aplicada à construção de clones de cDNA infecciosos para um punhado de vírus ARN de cadeia positiva, ou seja, dois JEVs, CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28 (tamanho do genoma, ~ 11 kb); dois vírus da dengue, BR / 90 26 e NGC 29 (~ 11 kb); o vírus da diarréia viral bovina, SD1 (~ 12 kb); 25 dois vírus da peste suína clássica, C e Paderborn (~ 12 kb); 24 o vírus da doença da fronteira, Gifhorn (~ 12 kb); 24 o vírus suíno síndrome reprodutiva e respiratória , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 o vírus da gastroenterite transmissível, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 o felino vírus da peritonite infecciosa,DF-2 (~ 29 kb); 32 a grave coronavírus Síndrome Respiratória Aguda, Urbani (~ 30 kb); 9 do Oriente Médio respiratória síndrome coronavírus, a EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 eo coronavírus humano, OC43 (~ 31 kb) 31 A principal vantagem da utilização de BACs para a construção de cDNA é a elevada estabilidade genética das grandes, 1- ou 2-cópia BAC plasmídeos.; No entanto, a natureza intrínseca da sua número extremamente baixo número de cópias é também uma grande desvantagem, devido a rendimentos muito baixos de DNA de BAC e a consequente redução na pureza do DNA de BAC com respeito à sede de ADN cromossómico. No protocolo atual, o rendimento de DNA BAC é maximizada pela crescente E. coli DH10B transformada com o pBAC BAC infecciosa / SA 14 -14-2 em um meio rico em nutrientes, 2xYT. Apesar deste esforço, o rendimento médio é de apenas ~ 15 ug de DNA BAC a partir de 500 ml de caldo de 2xYT. Além disso, a pureza do DNA de BAC é melhor conseguido através da utilização de CsCl-EtBr centrifugação de gradiente de densidade para a purificação, Em vez do plasmídeo de isolamento à base de coluna utilizada. No entanto, é importante ter em mente que a E. transformado BAC- coli não deve crescer demais porque pode pôr em perigo a estabilidade genética do cDNA clonado, e um crescimento mais elevado não conduz necessariamente a maiores rendimentos ou DNA BAC maior pureza.
O protocolo descrito aqui é um, e método aerodinâmico eficiente otimizada para a construção e propagação de um full-length cDNA infeccioso clone geneticamente estável como um BAC para JEV, um procedimento que se pensava praticamente impossível. Esta mesma estratégia de clonagem pode também ser aplicado a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva. Em geral, os clones de ADNc infecciosos permitir-nos introduzir uma variedade de mutações (por exemplo, deleções, inserções e mutações pontuais) num genoma de ARN viral para estudar as suas funções biológicas na replicação virai e patogénese. Este sistema de genética inversa à base de ADNc faz com que seja possível desenvolver e TESt vacina e candidatos terapêuticos que visam um factor de virulência (s) de um vírus de ARN de cadeia positiva de interesse particular. Além disso, esta tecnologia de cDNA infeccioso pode também ser utilizado como um vector virai, capaz de expressar um gene estranho (s) de interesse para muitas aplicações na investigação biomédica.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |