Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (AST) se lleva a cabo para evaluar la actividad in vitro de agentes antimicrobianos contra diversas bacterias. Los resultados de AST, que se expresan como concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) se utilizan en la investigación para el desarrollo de los antimicrobianos y la supervisión del desarrollo de resistencia y en el ámbito clínico como guía la terapia antimicrobiana. Dalbavancina es un agente antimicrobiano lipoglicopéptido semi-sintético que fue aprobado en mayo de 2014 la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para el tratamiento de infecciones de la piel y la estructura de la piel bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos. La ventaja de dalbavancina sobre las terapias anti-estafilocócicas actuales es su larga vida media, lo que permite la dosificación una vez por semana. Dalbavancina tiene actividad frente a Staphylococcus aureus (incluyendo tanto el S. aureus [MSSA] y resistente a la meticilina S. aureus [MRSA] sensible a meticilina), estafilococos coagulasa negativos, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo anginosus, estreptococos β-hemolítico y vancomicina enterococos susceptibles. Similar a otros agentes lipoglicopéptido recientes, la optimización de métodos de ensayo de susceptibilidad CLSI y el caldo ISO incluye el uso de sulfóxido de dimetilo (DMSO) como disolvente en la preparación de las soluciones madre y polisorbato 80 (P80) para aliviar la adherencia del agente de plástico. Antes de los estudios clínicos y durante el desarrollo inicial de dalbavancina, los estudios de susceptibilidad no se llevaron a cabo con el uso de P-80 y los resultados de CIM tendían a ser 2-4 veces mayor y de manera similar más alta MIC resultados se obtuvieron con el método de la susceptibilidad de dilución en agar. Dalbavancina se incluyó por primera vez en CLSI mesas metodología microdilución caldo en 2005 y enmendada en 2006 para aclarar el uso de DMSO y P-80. El procedimiento de microdilución en caldo (BMD) se muestra aquí es específico para dalbavancina y está en conformidad con los métodos CLSI e ISO, con el detalle paso a paso y FOCnosotros en los pasos críticos añadido para mayor claridad.
Dalbavancina es un lipoglicopéptido semi-sintético que fue aprobado por la FDA en mayo de 2014 en el tratamiento de infecciones de la piel y la estructura de la piel bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivas 1. El principal objetivo de detallar este método en un formato de vídeo es proporcionar una orientación clara a los científicos de laboratorio y la investigación clínica para las pruebas y la notificación de los resultados de sensibilidad dalbavancina exactos y reproducibles.
La determinación de un agente antimicrobiano MIC por métodos comerciales se realiza rutinariamente en los laboratorios clínicos para la evaluación de la actividad de un agente in vitro contra bacterias patógenas. El método aquí descrito es el método de microdilución en caldo según lo recomendado por CLSI e ISO 2,3,4. Desde dalbavancina métodos de susceptibilidad comerciales no están disponibles actualmente (en el momento de esta publicación) y de difusión en disco y los métodos de dilución en agar no se recomiendan actualmente fo dalbavancina, métodos de dilución de caldo de referencia son las opciones actuales disponibles 12,14. Como este método de referencia no es un comercial y aprobado por la FDA método de diagnóstico in vitro, los laboratorios clínicos en los EE.UU. que utilizan este procedimiento para las pruebas de los pacientes deben cumplir con los requisitos reglamentarios para una prueba desarrollada laboratorio (LDT). Se prevé que como el uso dalbavancina aumenta, más laboratorios tendrán una necesidad de probar este compuesto. Pruebas de vancomicina como un sustituto para la determinación de la susceptibilidad de S. dalbavancina aureus ha sido validado 5. Sin embargo, dalbavancina puede ser activo frente a la vancomicina intermedia S. aureus (VISA) y por lo tanto, los médicos pueden solicitar resultados de CIM dalbavancina. Además, los resultados de CIM para otras especies bacterianas pueden ser solicitados.
El punto de interrupción susceptible FDA para dalbavancina contra S. aureus se ha establecido en ≤0.12 mu g / ml. FDA asignado solamente un suscepticategoría ble debido a la falta de datos sobre cepas resistentes. La distribución normal MIC entre los de tipo salvaje S. aureus aislados es de entre 0,03 a 0,12 mg / ml, con una clara MIC modal de 0,06 g / ml. Una ligera variación en los resultados de CIM debido a la diferencia método, además de la variación inherente BMD de ± una dilución, lo que potencialmente podría tener un impacto significativo sobre las tasas de susceptibilidad. 6 De manera similar a otros agentes lipoglicopéptido, las pruebas de sensibilidad dalbavancina puede ser un reto como resultado de solubilidad y el tamaño relativamente grande de la molécula y sus propiedades de unión 7,8,9. El método BMD referencia aquí descrita incluye dos pasos específicos que son únicos a los agentes insolubles y / o agentes lipoglicopéptido: (1) el uso de DMSO para la preparación de las soluciones madre y (2) la adición de 0,002% P-80 en el panel MIC definitiva diluciones. El objetivo de esta publicación es de vídeo para proporcionar claridad al método BMD dalbavancina y para specificaLLY centrarse en estos pasos clave, para asegurar resultados de CIM exactos y reproducibles.
Los siguientes detalles de método se presentan consideraciones adicionales en la preparación para las pruebas de MIC dalbavancina. El diseño del panel MIC dependerá del número de agentes antimicrobianos a ensayar (es decir., Dalbavancina solo o múltiples agentes) y las especies de bacterias a ensayar. Las concentraciones dalbavancina deben abarcar los puntos de corte de interpretación para todas las especies bacterianas a ensayar y toda la gama de diluciones esperados durante al menos una cepa de control de calidad. La serie de dilución antimicrobiana puede ser organizada ya sea en filas o columnas en función del número de agentes antimicrobianos y / o aislados / placa y el método de la inoculación. El volumen de polvo dalbavancina y el caldo debe calcularse para asegurar que las cantidades óptimas son producidos y de los residuos es mínima. Para el ejemplo usado en esta publicación, los volúmenes se basan en preparación de dos paneles MIC. Cationes ajustados caldo Mueller Hinton debe estar preparado y en autoclave de acuerdo con el hombreinstrucciones y la esterilidad de los medios de ufacturer verificados. Paneles MIC se pueden hacer y se utilizan en el mismo día de la preparación o pueden ser probados con los organismos de control de calidad apropiados y los paneles validados almacenados congelados para uso futuro. Es importante utilizar técnicas estériles durante todo el procedimiento.
No hay criterios estrictos para la verificación de la concentración de inóculo con recuentos de colonias. Recuentos de colonias pueden ser revisados inicialmente para cada especie probados y / o periódicamente para validar el paso de dilución efectuada en el paso 4.2. Es importante que la validez de la norma McFarland 0.5 también se comprueba rutinariamente con E. coli ATCC 25922 usando un procedimiento similar al paso 4.5. Si los resultados no son equivalentes a 1.2 x 10 8 UFC / ml, se debe obtener un nuevo estándar McFarland 0,5. Si los recuentos de colonias de pozos MIC están fuera del rango aceptable (2-8 x / resultados ml y CIM 10 5 UFC para el aislado clínico (s) puede variar en cada ªe esperada distribución normal (por ejemplo. 0,03 a 0,12 ug / ml para S. aureus) y / o resultados de CIM para el aislado de control de calidad (s) están fuera de los rangos esperados, las pruebas de validación es necesaria y la modificación de métodos puede estar justificada. Se sugiere que un estándar McFarland 0,5 validado se utiliza para repetir el count (s) de la colonia y si los resultados son de nuevo fuera de los resultados esperados, la dilución del inóculo tal como se realiza en el paso 4.2 se debe ajustar en consecuencia y el MIC repite. Tenga en cuenta que un cheque pureza es necesario incluso si un recuento de colonias se realiza debido a que el procedimiento de recuento de colonias utiliza un volumen diluida que no se puede detectar necesariamente menores concentraciones de microorganismos contaminantes.
Para una prueba de MIC se considere válida, el crecimiento aceptable debe ocurrir en el control del crecimiento también. Para la mayoría de las bacterias que se pondrá a prueba en contra dalbavancina (es decir., Estafilococos, estreptococos y enterococos, el crecimiento se verá como un botón (típicamente> 2 mm) y menos frequently, el crecimiento puede aparecer como turbidez en el pozo. A diferencia de algunos agentes antimicrobianos que pueden presentar trailing efecto que las concentraciones aumentan, los puntos finales dalbavancina son bien definidos. Hay varios dispositivos de visualización destinadas a facilitar pruebas de microdilución de lectura, que se pueden usar para leer placas que contienen dalbavancina, siempre y cuando no hay compromiso en la capacidad de discernir el crecimiento en los pocillos.
Los pasos críticos en el protocolo están relacionadas con las partes del procedimiento que están relacionados con la solubilidad de dalbavancina y la adición de P80. Es importante que la concentración máxima de dalbavancina utilizado es no mayor de 1,600 g / ml, que el DMSO se usa como un disolvente y que las concentraciones de intermedios se preparan en DMSO antes de hacer las diluciones de caldo de modo que la concentración final de DMSO en el MIC panel de pozos no es mayor que 1%. DMSO es higroscópico y, por tanto, el uso de botellas más antiguas de DMSO era un EXAMENde iones con respecto a la solubilidad dalbavancina. Sin embargo, mientras que un estudio de la densidad mineral ósea pequeña con cepas de control de calidad ha demostrado que esto no sea una variable importante (ver sección de resultados), es una buena práctica utilizar botellas de DMSO nuevos o recientemente abiertos. También es importante que P80 se añade al caldo en la etapa final de la preparación de dilución de fármaco y está a una concentración final de 0,002% en el MIC también.
El procedimiento de la DMO incluye aquí utiliza preparación de paneles MIC utilizando 50 l / pocillo en dalbavancina y P-80 concentraciones dos veces la concentración final y la adición de inóculo con 50 l / pocillo de manera que el volumen final / pocillo es de 100 microlitros. Este método permite a un formato de panel MIC que deben prepararse para la prueba de ambos S. aureus y S. pneumoniae porque la sangre de caballo lisada se puede añadir al inóculo. Los métodos alternativos para la preparación de paneles MIC utilizando 100 l / pocillo con la adición de hasta 10 l / pocillo se describen en laProcedimientos CLSI e ISO.
El punto de ruptura susceptibles dalbavancina para S. aureus es ≤0.12 mg / ml (FDA prospecto). Como se muestra en la vigilancia reciente, la mayoría de los aislamientos son inhibidas por Dalbavancina a niveles de 0,06 g / ml 15. Con un punto de interrupción susceptible cerca de la MIC modal, cualquier variación en MIC como resultado de las diferencias de método puede afectar las tasas de susceptibilidad. Debido a que el procedimiento de la DMO para dalbavancina incluye algunos pasos únicos (en concreto, el uso de DMSO en la preparación de acciones y diluciones de fármaco intermedios y 0,002% P80 en el MIC bien, es imperativo que el método se sigue exactamente. El organismo S. aureus QC (ATCC 29213) con una muy clara MIC modal dalbavancina de 0,06 g / ml, ha sido un buen indicador de la variación de método y debe utilizarse de forma rutinaria para validar el método de la DMO. Si los resultados de CIM están con el rango esperado de 0,03 hasta 0,12 mg / ml, pero están en tendencia ya sea a la baja o high lado de este rango, mayor validación del método se justifica.
Se recomienda la adición de 0,002% P80 para todos los organismos Gram-positivas relevante (staphylococcci, enterococos y estreptococos.) Sin embargo, hay que destacar que se ha demostrado que lisadas sangre de caballo actúa similar a P-80 en relación con sus propiedades anti-unión capacidad y que la adición de P-80 a CAMHB + LHB no tiene ningún efecto adicional sobre los resultados de CIM estreptococos dalbavancina.
Actualmente no hay ningún método de difusión en disco para la prueba dalbavancina y debido a la pobre correlación de DMO y los resultados de AD, las pruebas de sensibilidad de dalbavancina utilizando el método de AD no se recomienda 12, 14. El método de la DMO se debe utilizar para la futura evaluación de la susceptibilidad dalbavancina y como método de referencia para el desarrollo de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana comerciales.
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |