Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
בדיקת רגישות מיקרוביאלית (AST) מתבצעת על מנת להעריך את הפעילות במבחנה של סוכני מיקרוביאלית נגד חיידקים שונים. תוצאות AST, שבאות לידי ביטוי כריכוזים מעכבים מינימליים (מיקרופונים) משמשות במחקר לפיתוח ולניטור מיקרוביאלית של פיתוח עמידות ובהגדרה הקלינית להדרכת טיפול אנטיביוטיה. Dalbavancin הוא סוכן מיקרוביאלית lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר מאי 2014 על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיוביים. היתרון של dalbavancin על טיפולים אנטי-staphylococcal הנוכחיים הוא זמן מחצית החיים הארוכים שלה, המאפשר למינון של פעם בשבוע. יש Dalbavancin פעילות נגד Staphylococcus aureus (כולל שני וmethicillin-רגיש S. aureus [MSSA] methicillin-resistant S. aureus [MRSA]) staphylococci, coagulase-שלילי, <em> Streptococcus pneumoniae, קבוצת סטרפטוקוקוס anginosus, סטרפטוקוקוס β-המוליטית וenterococci רגיש vancomycin. בדומה לסוכנים אחרים האחרונים lipoglycopeptide, אופטימיזציה של שיטות בדיקת רגישות CLSI ומרק ISO כולל את השימוש של sulfoxide דימתיל (DMSO) כממס בעת הכנת פתרונות מניות וpolysorbate 80 (P80) כדי להקל על דבקותו של הסוכן לפלסטיק. לפני המחקרים הקליניים ובפיתוח הראשוני של dalbavancin, מחקרי רגישות לא בוצעו תוך השימוש בP-80 ותוצאות MIC נטו להיות גבוה פי 2-4 ובאופן דומה הגבוה MIC תוצאות שהושגו עם שיטת רגישות הדילול אגר. Dalbavancin נכלל לראשונה בשולחנות מתודולוגיה microdilution מרק CLSI בשנת 2005 ותוקן בשנת 2006 כדי להבהיר שימוש בDMSO ו- P-80. Microdilution מרק ההליך (BMD) מוצג כאן הוא ספציפי לdalbavancin והנו בהתאם לשיטות CLSI ו- ISO, עם פירוט וfoc צעד-אחר-צעדשלנו בשלבים הקריטיים הוסיף לבהירות.
Dalbavancin הוא lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר על ידי ה- FDA מאי 2014 לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיובי 1. המטרה העיקרית של שיטה זו מפרטת בפורמט וידאו היא לספק הדרכה ברורה למדענים במעבדה ומחקרים הקליניים לבדיקה ודיווח של תוצאות רגישות dalbavancin מדויקות ושחזור.
הנחישות של סוכן מיקרוביאלית MIC בשיטות מסחריות מבוצעת באופן שגרתי במעבדות קליניות להערכת הפעילות במבחנה של סוכן נגד חיידקים פתוגניים. השיטה המתוארת כאן היא שיטת microdilution מרק כפי שהומלץ על ידי CLSI וISO 2,3,4. מאז dalbavancin שיטות רגישות מסחריות אינן זמינות כעת (בזמן של פרסום זה) ודיפוזיה דיסק ושיטות דילול אגר אינם מומלצים F כרגעאו dalbavancin, שיטות דילול מרק התייחסות הן האפשרויות הזמינות הנוכחיות 12,14. כשיטת התייחסות זו היא לא מסחרית וFDA פינה במבחנה שיטת אבחון, מעבדות קליניות בארה"ב המשתמשת בהליך זה לבדיקת מטופל חייב לציית לדרישות הרגולטוריות לבדיקת מעבדה פיתחה (LDT). זה צפוי כי ככל שעולה שימוש dalbavancin, תהיה יותר מעבדות צורך לבדוק מתחם זה. בדיקות Vancomycin כתחליף לקביעת רגישות dalbavancin של ס aureus אומת 5. עם זאת, dalbavancin עשוי להיות פעיל נגד ס ביניים vancomycin aureus (ויזה) ולכן, רופאים יכולים לבקש תוצאות MIC dalbavancin. בנוסף, תוצאות MIC למיני חיידקים אחרים ניתן לבקש.
נקודת העצירה רגישה FDA לdalbavancin נגד ס aureus כבר נקבע ב≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר. ה- FDA הוקצה רק susceptiהקטגוריה ble בגלל המחסור בנתונים על בידודים עמידים. הפצת MIC הנורמלית בין הסוג בר ס aureus המבודד הוא בין 0.03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, עם MIC מודאלי ברור של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר. וריאציה קלה בתוצאות MIC בשל הבדל בשיטה, בנוסף לוריאצית BMD הטבועה של ± אחד דילול, עלולה להיות השפעה משמעותית על שיעורי הרגישות. 6 דומים לסוכני lipoglycopeptide אחרים, בדיקת רגישות dalbavancin יכולה להיות מאתגרות כתוצאה של מסיסות והגודל גדול יחסית של המולקולה ומאפייניה מחייבים 7,8,9. שיטת BMD ההתייחסות המתוארת כאן כוללת שני צעדים ספציפיים שהנם ייחודיים לסוכנים מסיסים ו / או סוכני lipoglycopeptide: (1) השימוש בDMSO להכנת פתרונות מניות ו( 2) תוספת של 0.002% P-80 בלוח MIC הסופי דילולים. המטרה של פרסום וידאו זה היא לספק בהירות לשיטת BMD dalbavancin ולspecifically להתמקד בצעדים מפתח אלה, כדי להבטיח תוצאות MIC מדויקות ושחזור.
פרטי השיטה הבאות מוצגים לשיקולים נוספים בעת הכנה לבדיקת MIC dalbavancin. העיצוב של לוח MIC יהיה תלוי במספר סוכני מיקרוביאלית להיבדק (כלומר., Dalbavancin לבד או סוכנים מרובים) והמינים של חיידקים להיבדק. ריכוזי dalbavancin צריכים להקיף את נקודות העצירה הפרשניות לכל מיני החיידקים שנבדקו ואת כל הטווח של דילולים צפויים לפחות אחד זן QC. סדרת דילול מיקרוביאלית יכולה להיות מאורגנת בשורות או עמודות בהתאם למספר סוכני מיקרוביאלית ו / או מבודד / צלחת ושיטה של חיסון. הנפח של אבקת מרק dalbavancin וצריך להיות מחושב כדי להבטיח שכמויות אופטימליות מיוצרות והפסולת היא מינימאלית. לדוגמא בשימוש בפרסום זה, כרכים מבוססים על הכנת שני פנלי MIC. מרק מילר הינטון קטיון הותאם צריך להיות מוכן וautoclaved לפי אדםההוראות ועקרות של התקשורת של ufacturer מאומתים. לוחות MIC יכולים להתבצע ומשמשים באותו יום של הכנה או שהם יכולים להיבדק עם אורגניזמים בקרת האיכות מתאימים ולוחות תוקף מאוחסנים קפוא לשימוש עתידי. חשוב להשתמש בטכניקות סטרילי לאורך כל ההליך.
אין קריטריונים נוקשים לאימות של ריכוז הבידוד עם ספירת מושבה. ספירת מושבה יכולה להיבדק בתחילה לכל מינים נבדקו ו / או מעת לעת כדי לאמת את צעד הדילול מתבצע בשלב 4.2. חשוב שהתוקף של תקן מק 'פרלנד 0.5 גם בדק באופן שיגרתי עם E. coli ATCC 25922 באמצעות הליך דומה לצעד 4.5. אם התוצאות אינן שווה ערך ל1-2 x 10 8 CFU / ml, יש לקבל סטנדרטי מק 'פרלנד 0.5 חדש. אם ספירת המושבה מבארות MIC נמצא מחוץ לטווח המקובל (2-8 10 5 CFU תוצאות x / מיליליטר וMIC לבודד הקליני (ים) משתנות מהדואר צפוי התפלגות נורמלית (לדוגמא. 0.03-.12 UG / מיליליטר לS. aureus) ו / או תוצאות MIC לבודד בקרת איכות (ים) נמצאות מחוץ לטווח צפוי, בדיקות אימות היא הכרחיות ושינוי שיטה עשוי להיות מוצדקים. הוא הציע כי 0.5 סטנדרטי מק 'פרלנד תוקף משמש לחזור על ספירת המושבה (ים), ואם תוצאות הן שוב מחוץ לתוצאות צפויות, דילול הבידוד כפי שבוצע בשלב 4.2 צריך להיות בהתאם וMIC חוזר ונשנה. שים לב שבדיקת טוהר היא הכרחית גם אם ספירת מושבה מתבצעת כי הליך ספירת המושבה משתמש נפח מדולל שלא בהכרח לזהות ריכוזים נמוכים של אורגניזמים מזהמים.
לבדיקת MIC להיחשב חוקית, צמיחה מקובלת חייבת להתרחש בשליטת הצמיחה גם. עבור רוב החיידקים שייבחנו נגד dalbavancin (כלומר., Staphylococci, סטרפטוקוקוס וenterococci, צמיחה שנראה כמו כפתור (בדרך כלל> 2 מ"מ) ופחות frequently, צמיחה עשויה להופיע כעכירות בבאר. בניגוד לכמה סוכני מיקרוביאלית שעשויה להפגין נגררים השפעת הריכוזים להגדיל, נקודות קצה dalbavancin מוגדרות בדרך כלל היטב. ישנם מכשירים שונים שנועדו להקל על הצפייה בדיקות microdilution הקריאה, אשר עשוי לשמש לקריאת צלחות המכילות dalbavancin כל עוד אין פשרה ביכולת להבחין בצמיחת הבארות.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול הקשורות לחלקים של ההליך שאינם קשורים למסיסות של dalbavancin ותוספת של P80. חשוב שאת הריכוז המרבי של dalbavancin משמש הוא לא יותר מ -1,600 / מיקרוגרם מיליליטר, DMSO המשמש כממס וכי ריכוזי ביניים ערוכים DMSO לפני ביצוע דילולים המרק כך שהריכוז הסופי של DMSO בMIC פנל הבארות אינן עולים על 1%. DMSO הוא hygroscopic ולכן, השימוש בבקבוקים ישנים יותר של DMSO היה consideratיון ביחס למסיסות dalbavancin. עם זאת, בעוד שמחקר BMD קטן עם זני בקרת האיכות הוכיח את זה לא כדי להיות משתנה חשוב (ראה סעיף תוצאות), זה תרגול טוב להשתמש בבקבוקים חדשים או שנפתחו לאחרונה של DMSO. כמו כן, חשוב שP80 מתווסף המרק בשלב האחרון של הכנת דילול תרופה והוא בריכוז סופי של 0.002% בMIC כן.
הליך BMD כלול כאן מנצל הכנת לוחות MIC באמצעות 50 μl / גם בdalbavancin ו- P-80 ריכוזים שתי פעמים הריכוז הסופי ותוספת של הבידוד עם 50 μl / כל כך טוב שנפח סופי / גם הוא 100 μl. שיטה זו מאפשרת לפורמט פנל MIC אחד להיות מיוצר לבדיקה של שני ס aureus וס pneumoniae כי דם סוס lysed ניתן להוסיף לבידוד. שיטות אלטרנטיביות להכנת לוחות MIC באמצעות 100 μl / גם עם תוספת של עד 10 μl / גם מתוארות בנהלי CLSI ו- ISO.
נקודת העצירה רגישה dalbavancin לס aureus הוא ≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר (עלון FDA). כפי שמוצג במעקב האחרון, רוב מבודדים מעוכבים על ידי dalbavancin ברמות של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר 15. עם נקודת עצירה רגישה קרוב לMIC מודאלית, כל שינוי בMIC כתוצאה מהבדלים בשיטה יכול להשפיע על שיעורי רגישות. בגלל הליך BMD לdalbavancin כולל כמה שלבים ייחודיים (במיוחד, השימוש בDMSO בהכנת מניות ודילולי תרופת ביניים וP80 0.002% בMIC טוב, זה הכרחי כי השיטה המיושמת בדיוק. האורגניזם S. aureus QC (ATCC 29,213) עם MIC מודאלי dalbavancin מאוד ברור של 0.06 מיליליטר מיקרוגרם /, היה אינדיקטור טוב של וריאציה שיטה ויש להשתמש באופן שיגרתי כדי לאמת את שיטת BMD. אם תוצאות MIC הן עם הטווח הצפוי של .03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, אך במגמה לאו נמוך או HIGצד שעות של טווח זה, אימות נוספת של השיטה היא מוצדקת.
התוספת של P80 0.002% מומלצת לכל היצורים גרם-חיובי רלוונטי (staphylococcci, enterococci, וסטרפטוקוקוס.) עם זאת, ראוי לציין כי זה כבר הראה כי lysed דם סוס פועל בדומה לP-80 ביחס לה אנטי-מחייב יכולת וכי התוספת של P-80 לCAMHB + LHB אין כל השפעה נוספת על תוצאות MIC סטרפטוקוקוס dalbavancin.
אין כרגע שיטת דיפוזיה דיסק לdalbavancin בדיקות ובגלל עניי המתאם של BMD ותוצאות הספירה, בדיקת רגישות של dalbavancin בשיטת הספירה אינו מומלצת 12, 14. שיטת BMD צריכה לשמש להערכה העתידית של רגישות dalbavancin וכתקן זהב לפיתוח בדיקות רגישות מיקרוביאלית מסחריות.
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |