Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
抗菌剤感受性試験(AST)は、様々な細菌に対する抗菌剤のin vitro活性を評価するために行われます。最小阻止濃度(MIC)として表されるAST結果は、耐性の発達の抗菌剤の開発および監視のための研究及び抗菌療法の指導のための臨床設定において使用されています。ダルババンシンは、グラム陽性菌によって引き起こされる急性細菌性皮膚及び皮膚構造感染症の治療のための食品医薬品局(FDA)によって2014年5月に承認された半合成lipoglycopeptide抗菌剤です。現在の抗ブドウ球菌の治療法を超えるダルババンシンの利点は、週1回投与を可能にし、その長い半減期、です。ダルババンシンは、 黄色ブドウ球菌 (メチシリン感受性黄色ブドウ球菌 [MSSA]およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 [MRSA]の両方を含む)、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に対する活性を有します<em>肺炎球菌、 ストレプトコッカス・anginosusグループ 、β溶血性連鎖球菌およびバンコマイシン感受性の腸球菌。他の最近のlipoglycopeptide剤と同様に、CLSIおよびISOブロス感受性試験法の最適化は、プラスチックへの薬剤の付着を軽減するためにストック溶液およびポリソルベート80(P80)を調製する溶媒としてジメチルスルホキシド(DMSO)の使用を含みます。臨床試験へとダルババンシンの初期開発時に先立ち、感受性試験は、P-80を使用して行い、MICの結果が2-4倍高いと同様に高いMICの結果は寒天希釈感受性法で得られた傾向にあっていませんでした。ダルババンシンは、2005年に初めてCLSIブロス微量の方法論テーブルに含まれており、DMSOとP-80の使用を明確にするため、2006年に改正されました。微量液体希釈ここに示されている(BMD)の手順では、ダルババンシンに固有であり、ステップ・バイ・ステップの詳細やFOCで、CLSIおよびISO方法によるものです重要なステップの私たちは、明確にするために追加されました。
ダルババンシンは、グラム陽性菌1によって引き起こされる急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の治療のために2014年5月にFDAにより承認された半合成lipoglycopeptideです。ビデオフォーマットでは、この方法を詳述の主な目的は、正確で再現性のダルババンシン感受性結果の検査と報告のための臨床検査室や研究科学者に明確な指針を提供することです。
商業的方法による抗菌剤のMICの決意を日常的に病原性細菌に対する薬剤のインビトロ活性の評価のための臨床検査室で行われます。 CLSIとISO 2,3,4により推奨されるように、ここで説明する方法は、微量液体希釈法です。ディスク拡散および寒天希釈法(本書の発行時点で)商業感受性方法が現在利用可能ではないので、ダルババンシン現在Fが推奨されていませんまたはダルババンシン、参照ブロス希釈法は、12,14利用できる現在のオプションです。この参照方法は、商業やFDAはインビトロ診断法をクリアされないように、患者のテストのために、この手順を使用し、米国での臨床検査室、実験室開発テスト(LDT)のための規制要件を遵守しなければなりません。これは、ダルババンシンの使用が増加するにつれて、より多くの研究室は、この化合物をテストする必要があろうことが予想されます。 Sのダルババンシン感受性の決意の代理としてバンコマイシンのテスト黄色ブドウ球菌は 5確認されています。しかし、ダルババンシンは、バンコマイシン中間S.に対して活性であり黄色ブドウ球菌 (VISA)、したがって、臨床医は、ダルババンシンのMICの結果を要求することができます。加えて、他の細菌種に対するMIC結果を要求することができます。
S.に対するダルババンシンのためのFDAの影響を受けやすいのブレークポイント黄色ブドウ球菌は ≤0.12/ mlの時に確立されています。 FDAの割り当てのみsusceptiなぜなら耐性分離株に関するデータの欠如のBLEカテゴリ。野生型S.間の通常のMIC分布黄色ブドウ球菌は 0.06μgの/ mlの明確なモーダルMICと、0.03から0.12μgの/ mlの間で分離します。方法の違いにMICの結果に若干のばらつきは、±1希釈の固有のBMD変化に加えて、潜在的に感受性率に大きな影響を与える可能性があります。他のlipoglycopeptideの薬剤と同様に図6に示すように、ダルババンシンの感受性試験は、結果として挑戦することができます溶解性および7,8,9分子およびその結合特性の比較的大きな。本明細書に記載の参照BMD法は、不溶性剤および/またはlipoglycopeptideエージェントに固有の2つの特定の工程を含む:(1)最終MICパネルでストック溶液の製造及び0.002%P-80の(2)追加のためのDMSOの使用希釈液。このビデオ公開の目的は、ダルババンシンBMD方法と書または仕様書に明確さを提供することですLLY、正確で再現性のMICの結果を保証するために、これらの重要なステップに焦点を当てています。
ダルババンシンのMIC試験のための準備をするときは、次の方法の詳細は、追加の考慮事項については提示されています。 MICパネルの設計は、試験される抗菌剤の数( すなわち 、単独でダルババンシンまたは複数のエージェント)と試験される細菌の種類に依存するであろう。ダルババンシン濃度は、試験されるすべての細菌種及び少なくとも一つのQC株について期待される希釈液の全範囲のための解釈のブレークポイントを含むべきです。抗菌希釈系列は、抗菌剤および/または/プレートと接種方法を分離するの数に応じて行または列のいずれかで編成することができます。ダルババンシン粉末及び培養液の量は、最適な量が生産されることを保証するように計算されるべきであり、廃棄物が最小です。このマニュアルで使用されている例えば、ボリュームは2 MICパネルの準備に基づいています。陽イオン調整ミューラーヒントンブロスは男に従って調製し、オートクレーブ処理する必要がありますufacturerの指示とメディアの無菌性を検証しました。 MICのパネルを作製し、使用する準備の同じ日に、またはそれらは、適切な品質管理生物、将来の使用のために凍結保存された検証済みのパネルを用いて試験することができることができます。これは、作業中の滅菌技術を使用することが重要です。
コロニー数と接種濃度の検証のための厳密な基準はありません。コロニー数は、ステップ4.2で実行希釈工程を検証するために定期的にテストおよび/またはそれぞれの種のために最初にチェックすることができます。これは、0.5マクファーランド標準の妥当性もEで日常的にチェックされていることが重要です4.5ステップと同様の手順を使用して大腸菌 ATCC 25922。結果は1〜2×10 8 CFU / mLに等価でない場合は、新しい0.5マクファーランド標準が得られるはずです。 MICウェルからのコロニー数が許容範囲の外にある場合(臨床分離株(複数可)2-8×10 5 CFU / mlであり、MICの結果は目から変わります電子期待正規分布(例えば、 黄色ブドウ球菌のための0.03から0.12 UG / mlで)、および/ または品質管理単離物(複数可)のMICの結果は、予想される範囲外で、検証テストが必要でありされ、方法の変更を保証することができます。これは、検証0.5マクファーランド標準のコロニー数(S)を繰り返すために使用されることが示唆されているとの結果が期待される結果の外に再度ある場合、ステップ4.2において実行される接種物の希釈は、それに応じて調整されるべきであり、MICを繰り返します。コロニー数手順は必ずしも汚染生物のより低い濃度が検出されない場合があり希釈ボリュームを使用するため、コロニー数を行っても純度のチェックが必要であることに注意してください。
MIC試験が有効と見なされるためには、許容可能な成長がよく増殖制御で実行する必要があります。ダルババンシン(すなわち、ブドウ球菌、連鎖球菌および腸球菌に対してテストされますほとんどの細菌は、成長がボタン(通常は> 2mm)を、より少ないFRとして見られますequently、成長がよくで濁度として表示されることがあります。濃度が増加するような効果を示すことができるいくつかの末尾の抗菌剤とは異なり、ダルババンシンのエンドポイントは、通常、十分に定義されています。限り井戸の成長を識別する能力には妥協がないようダルババンシン含むプレートを読み取るために使用することができる読み取り微量希釈試験を容易にするために意図された種々の観察装置があります。
プロトコル内の重要なステップは、ダルババンシン及びP80の追加の溶解性に関連する手順の一部に関連しています。前のブロス希釈液を作製するために使用されるダルババンシンの最大濃度は、DMSOを溶媒として使用することが、大きくない1600よりμgの/ mlであることが重要であり、中間の濃度はDMSO中で調製されるMICでのDMSOの最終濃度となるようパネルのウェルは、1%以下です。 DMSOは吸湿性であり、従って、DMSOの古いボトルの使用はconsideratましたダルババンシンの溶解性に関してイオン。品質管理株を持つ小さなBMDの研究は、(結果のセクションを参照)重要な変数ではないことが、これを示しているがしかし、それは、DMSOの新規または最近開いたボトルを使用することをお勧めします。それは、P80は、薬物希釈調製の最終段階で培養液に添加されることも重要であるとよくMICにおける0.002%の最終濃度です。
BMDの手順は、ここに含ま/ウェルの最終容量は100μlでなるように50μl/ウェルで50μL/ウェルダルババンシンでとP-80濃度の2倍の最終濃度と接種物の追加を使用してMICパネルの製造を利用しています。この方法は、両方のSのテストのために生成される1つのMICパネル形式を可能にします黄色ブドウ球菌およびS.肺炎溶解したウマ血液を接種物に添加することができるからです。最大10μL/ウェルを添加した100μl/ウェルを用いて、MICパネルを製造するための別の方法は、に記載されていますCLSIおよびISO手順。
S.のためのダルババンシン影響を受けやすいのブレークポイント黄色ブドウ球菌は ≤0.12/ mlの(FDAの添付文書)です。最近のサーベイランスに示すように、単離物の大部分は、0.06 / mlの15のレベルでのダルババンシンによって阻害されます。近くモーダルMICの影響を受けやすく、ブレークポイントでは、方法の違いの結果として、MICの変動は、感受性率に影響を与えることができます。ダルババンシンのためのBMD手順は(いくつかのユニークなステップを含んでいるので、特に、よくMICの株式と中間薬物希釈液0.002%のP80の準備中のDMSOの使用は、この方法は正確に続いていることが不可欠です。 黄色ブドウ球菌 QC生物0.06μgの/ mlの非常に明確なダルババンシンモーダルMICと(ATCC 29213)、メソッド変化の良好な指標となっているとBMD法を検証するために日常的に使用されるべきである。MICの結果は0.03から0.12μgのの予想範囲としている場合/ mlのが、低またはHIGのいずれかに傾向にありますこの範囲のH側には、この方法の更なる検証が保証されます。
0.002%のP80の添加は、関連するすべてのグラム陽性菌のために推奨される(staphylococcci、腸球菌、および連鎖球菌)。しかし、それは溶解したウマ血液が抗結合にP-80の相対的に類似作用することが示されたことは注目に値します能力とCAMHB + LHBにP-80の添加は、ダルババンシン連鎖球菌のMICの結果に何の付加的な効果を持っていないこと。
そこの試験ダルババンシンのためのディスク拡散法は、現在ではありませんし、悪いため、BMDの相関およびAD結果、AD法を用いて、ダルババンシンの感受性試験の12、14をお勧めしません。BMD法は、ダルババンシン感受性の今後の評価に使用されるべきです商業抗菌薬感受性試験の開発のためのゴールドスタンダードとして。
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |