Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Тестирование антимикробной восприимчивости (АСТ) выполняется для оценки активности в пробирке антимикробных агентов против различных бактерий. Результаты АСТ, которые выражаются в минимальные ингибирующие концентрации (МИК) используются в научных исследованиях для антимикробной развития и мониторинга развития резистентности и в клинических условиях для антимикробной терапии руководством. Dalbavancin является полусинтетический lipoglycopeptide антимикробный агент, который был утвержден в 2014 году мая за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения острых бактериальных кожи и структуры кожи инфекций, вызванных грам-положительных организмов. Преимущество далбаванцина над текущим анти-стафилококковых терапии является его длительный период полувыведения, что позволяет один раз в неделю дозирования. Dalbavancin обладает активностью в отношении золотистого стафилококка (в том числе как метициллиночувствительные золотистого стафилококка [MSSA] и метициллин-устойчивый золотистого стафилококка MRSA []), коагулазонегативными стафилококков, <em> Пневмококк, стрептококк группы anginosus, β-гемолитический стрептококк и ванкомицин подвержены энтерококки. Как и в других недавних агентов lipoglycopeptide, оптимизации методов испытаний восприимчивость CLSI и ИСО бульона включает в себя использование диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве растворителя при приготовлении исходных растворов и полисорбат 80 (P80), чтобы облегчить прилипание агента пластика. До клинических исследований и в ходе первоначального развития далбаванцина, восприимчивость исследования не проводились с использованием Р-80 и МИК, как правило, 2-4 раза выше, и аналогично выше МИК результаты были получены с агаровой методом разведения восприимчивости. Dalbavancin был впервые включен в CLSI бульон микроразведений таблиц методологии в 2005 году и внесены изменения в 2006 году для уточнения использования ДМСО и P-80. Отвар микроразведений (БМД) порядок, показанный здесь, специфичные для далбаванцина и в соответствии с CLSI и ISO методов, с шаг за шагом подробно и ВОКнам на критических шагов добавил для ясности.
Dalbavancin является полусинтетический lipoglycopeptide, который был одобрен FDA в мая 2014 года для лечения острых бактериальных кожи и структуры кожи инфекций, вызванных грам-положительных организмов 1. Основная цель подробно этот метод в видео формате, чтобы обеспечить четкое руководство к клинической лабораторной и научно-исследовательских ученых для тестирования и отчетности точных и воспроизводимых результатов Dalbavancin восприимчивости.
Регулярно осуществляется Определение антимикробного агента MIC коммерческими методами в клинических лабораториях для оценки деятельности агента в пробирке против патогенных бактерий. Метод, описанный здесь метод микроразведений бульон, как рекомендовано CLSI и ISO 2,3,4. Так Dalbavancin коммерческие методы восприимчивость не доступны в данный момент (на момент данной публикации) и диффузии диска и агар методов разведения в настоящее время не рекомендуется Fили Dalbavancin, методы разведения ссылка бульон текущие варианты 12,14. Как это эталонный метод не является коммерческим и FDA очищается диагностический метод в пробирке, клинические лаборатории в США, которые используют эту процедуру для тестирования пациента должны соблюдать нормативные требования для лабораторного испытания разработанной (LDT). Предполагается, что по мере увеличения использования Dalbavancin, больше лабораторий будет иметь необходимость проверить это соединение. Ванкомицин тестирование как суррогат для определения Dalbavancin восприимчивости S. стафилококк был утвержден 5. Тем не менее, Dalbavancin могут быть активными против устойчивых к ванкомицину S. промежуточной стафилококк (VISA) и, следовательно, врачи могут запросить результаты Dalbavancin MIC. Кроме того, МИК для других видов бактерий могут быть запрошены.
В FDA подвержены останова для далбаванцина против S. стафилококк был установлен в ≤0.12 мкг / мл. FDA назначается только susceptiBLE категории из-за отсутствия данных о резистентных штаммов. Нормальное распределение МИК среди дикого типа S. стафилококк изолятов между 0.03-0.12 мкг / мл, с четким модальной МИК 0,06 мкг / мл. Небольшое изменение в МИК-за разницы метода, в дополнение к присущей изменения МПК ± одним разведения, может оказать существенное влияние на темпы восприимчивости. 6 Как и в других lipoglycopeptide агентов, Dalbavancin восприимчивость тестирования может быть сложной задачей в результате растворимости и относительно большого размера молекулы и ее связывающими свойствами 7,8,9. Ссылка метод БМД описано здесь включает в себя два конкретных шагов, которые являются уникальными для нерастворимых веществ и / или lipoglycopeptide агентов: (1) использование ДМСО для приготовления растворов и (2) добавлением 0,002% P-80 в конечном панели MIC разведения. Целью данного видео публикации чтобы обеспечить ясность методу Dalbavancin BMD и specificaLLY сосредоточиться на этих ключевых шагов, чтобы обеспечить точные и воспроизводимые результаты MIC.
Следующие сведения метод представлены дополнительные соображения при подготовке к Dalbavancin MIC тестирования. Конструкция MIC панели будет зависеть от количества антимикробных агентов, которые будут проверены (т.е.., По отдельности или несколько агентов Dalbavancin) и видов бактерий, которые будут проверены. Концентрации Dalbavancin должен охватывать толкования точки останова для всех видов бактерий, чтобы быть проверены и весь спектр разведения ожидаемых по крайней мере одного штамма контроля качества. Серия противомикробное разбавления могут быть организованы либо в строках или столбцах в зависимости от количества антимикробных агентов и / или изолирует / пластину и способ прививки. Объем Dalbavancin порошка и отвара должна быть рассчитана заверить, что оптимальные суммы производится и отходы минимальны. Для примера, используемого в данной публикации, объемы основаны на подготовке двух микрофонных панелей. Катион регулировать Мюллер Хинтон бульон должен быть подготовлен и в автоклаве в соответствии с человекаинструкции и стерильность СМИ ufacturer в проверке. MIC панели могут быть получены и использованы на тот же день подготовки или они могут быть проверены с соответствующими контроля качества организмов и проверенных панелей хранят в замороженном для использования в будущем. Важно использовать стерильные методики в течение всей процедуры.
Там нет строгих критериев для проверки концентрации инокулята с подсчета колоний. Подсчета колоний может быть проверено первоначально для каждого испытанного и / или периодически проверять на стадии разбавления, выполненного на этапе 4.2 видов. Важно, что действия стандарта 0.5 Макфарланда также проверяется регулярно с Е. палочка АТСС 25922, используя методику, аналогичную шагу 4.5. Если результаты не эквивалентны 1-2 х 10 8 КОЕ / мл, новый стандарт 0,5 McFarland должны быть получены. Если колония насчитывает от ВПК скважин за пределами допустимого диапазона (2-8 х 10 5 КОЕ / мл и MIC Результаты клинического изолята (ов) варьируются от йе Ожидается, нормальное распределение (например. 0.03-0.12 мкг / мл для золотистого стафилококка) и / или MIC Результаты контроля качества изолята (ов) находятся за пределами ожидаемых диапазонов, тестирование проверки необходимо и модификация метода может быть оправдано. Он предположил, что подтверждено стандартом 0.5 Макфарлэнд используется, чтобы повторить отсчет (ы) колонии, и если результаты вновь находятся за пределами ожидаемых результатов, разведение посевной, как выполняется на этапе 4.2, должны быть соответствующим образом скорректированы и ВПК повторяется. Обратите внимание, что проверка чистота необходимо, даже если количество колоний выполняется потому, что процедура подсчета колонии использует разбавленный объем, который не обязательно обнаружения низких концентраций загрязняющих организмов.
Для ВПК тест считается действительным, приемлемой рост должен происходить в контроле роста также. Для большинства бактерий, которые будут испытаны в отношении далбаванцина (т.е.., Стафилококки, стрептококки и энтерококки, рост будет рассматриваться как кнопки (обычно> 2 мм) и менее FRequently, рост может появиться мутности в скважине. В отличие от некоторых антимикробных агентов, которые могут проявлять силу, как конечные концентрации возрастают, конечные точки Dalbavancin, как правило, четко определены. Есть различные устройства, предназначенные для просмотра облегчить чтение микроразведений тесты, которые могут быть использованы для чтения Dalbavancin, содержащие пластины, пока нет никакого компромисса в способности различать рост в лунках.
Критические шаги в протоколе, связанные с частями в порядке, которые имеют отношение к растворимости далбаванцина и добавления P80. Важно, чтобы максимальная концентрация далбаванцина используется не превышает 1600 мкг / мл, что ДМСО используется в качестве растворителя, и что промежуточные концентрации готовят в ДМСО до принятия бульона разведений, так что конечная концентрация ДМСО в ВПК Панель скважин не больше, чем на 1%. ДМСО гигроскопичен и, следовательно, использование старых бутылок ДМСО был consideratиона с учетом растворимости Dalbavancin. Тем не менее, в то время как небольшое исследование БМД штаммами контроля качества показали, что это не будет важной переменной (см результаты раздел), это хорошая практика, чтобы использовать новые или недавно открытые бутылки ДМСО. Важно также, что Р80 добавляется к бульону на конечной стадии подготовки разведений лекарственного средства и при конечной концентрации 0,002% в ВПК скважины.
Процедура БМД включены использует препарат МИК панелей с использованием 50 мкл / лунку в далбаванцина и Р-80 концентрации в два раза, чтобы конечная концентрация и добавлением инокулята с 50 мкл / лунку так, чтобы конечный объем / лунку в 100 мкл. Этот метод позволяет в течение одного ВПК Формат панели должны быть произведены для тестирования как S. стафилококк и С. пневмонии, потому что лизируют лошадиной крови могут быть добавлены к инокулята. Альтернативные способы получения МИК панелей с использованием 100 мкл / лунку с добавлением до 10 мкл / лунку описаны вCLSI и ISO процедуры.
Dalbavancin подвержены останова для S. стафилококк является ≤0.12 мкг / мл (FDA пакет вставки). Как показано на недавнем наблюдением, большинство штаммов ингибируется Dalbavancin в количестве 0,06 мкг / мл 15. С чувствительными останова недалеко от модального MIC, любое изменение в ВПК, в результате различий метод может повлиять на восприимчивость ставок. Поскольку процедура БМД для далбаванцина включает в себя несколько уникальных шагов (в частности, использование ДМСО в подготовке акции и промежуточных разведений наркотиков и 0,002% P80 в ВПК Ну, это важно, что метод выполняется в точности. Организм золотистого стафилококка КК (АТСС 29213) с очень четким Dalbavancin модального MIC 0,06 мкг / мл, был хорошим индикатором метода вариации и должен быть регулярно использован для проверки метода BMD. Если MIC результаты с ожидаемого диапазона 0.03-0.12 мкг / мл, но имеют тенденцию либо к низкой или HIGч сторона этого диапазона, дальнейшая проверка метода является оправданным.
Добавление 0,002% P80 рекомендуется для всех значимых грамположительных организмов (staphylococcci, энтерококков, и стрептококки.) Тем не менее, следует отметить, что было показано, что лизису лошадиной крови действует аналогично Р-80 по отношению к его анти-связывания Возможность и добавлением P-80 до + CAMHB LHB не имеет никакого дополнительного эффекта на Dalbavancin стрептококков МИК.
Там в настоящее время нет метода диск диффузии тестирования далбаванцина и из-за плохого соотношения МПК и результатов AD, восприимчивости тестирования далбаванцина методом AD не рекомендуется 12, 14. Метод БМД должны быть использованы для будущей оценки Dalbavancin восприимчивости и как золотой стандарт для разработки коммерческих антимикробных испытаний чувствительности.
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |