Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
药敏试验(AST)被执行以评估对各种细菌的抗微生物剂的体外活性。 AST的结果,这被表示为最低抑菌浓度(MIC)用于研究抗性发展的抗微生物发展和监测,并在临床上用于抗微生物治疗的指导。达巴万星的是,被批准在美国食品和药物管理局(FDA)2014年5月为急性细菌性皮肤和皮肤结构感染引起的革兰氏阳性生物体的治疗的半合成脂糖肽类抗微生物剂。达巴万星过电流抗葡萄球菌疗法的优点是它的半衰期长,其允许每周一次给药。达巴万星具有对金黄色葡萄球菌的活性(包括甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌 [MSSA]和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 [MRSA]),凝固酶阴性葡萄球菌, <em> 肺炎链球菌, 咽颊炎基,β溶血性链球菌和万古霉素敏感肠球菌。类似于其他最近脂糖肽类代理商,CLSI和ISO肉汤易感性试验方法优化包括使用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂的制备储备溶液和聚山梨醇酯80(P80)时,以缓解剂塑料的粘附。在此之前的临床研究和达巴万星的初始开发期间,未进行与使用的P-80的敏感性的研究和MIC结果往往是2-4倍高且类似更高的MIC结果与琼脂稀释易感性的方法获得的。达巴万星首次被列入CLSI肉汤稀释方法表中2005年和2006年修订,以澄清使用DMSO和P-80的。的微量肉汤稀释这里显示(BMD)程序是特定于达巴万星,是按照CLSI和ISO方法,用步骤一步细节和FOC我们的关键步骤增加了清晰度。
达巴万星的是,于2014年5月由FDA批准用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染引起的革兰氏阳性生物体1的治疗的半合成脂糖肽类。在视频格式详述此方法的主要目标是对临床实验室和研究科学家用于测试的准确和可重复的达巴万星的敏感性的结果和报告提供明确的指导。
是经常在临床实验室进行了对致病菌代理的体外活性评价的抗菌剂MIC商业方法的确定。这里介绍的方法是微量肉汤稀释法所推荐的CLSI和ISO 2,3,4。由于达巴万星的商业敏感性的方法是当前不可用(在本出版物的时间)和纸片和琼脂稀释方法目前不推荐˚F或者万星,参考肉汤稀释方法可用12,14当前选项。如该参考文献的方法不是一个商业和FDA批准的体外诊断方法,临床实验室中使用此过程病人测试必须通过用于实验室开发的测试(LDT)法规要求遵守美国。可以预料,随着达巴万星使用的增加,更多的实验室将有需要测试此化合物。万古霉素测试作为替代测定S.万星敏感性金黄色葡萄球菌已确认5。然而,达巴万星可有效对抗万古霉素中间体S.金黄色葡萄球菌 (VISA),因此,临床医生可以要求万星MIC结果。另外,MIC结果其他细菌物种可以请求。
美国食品药物管理局容易断点万星对S.金黄色葡萄球菌已建立在≤0.12微克/毫升。 FDA指定只有易感性BLE类别由于缺乏对耐药株的数据。其中野生型S.正常MIC分布金黄色葡萄球菌分离株是/毫升之间0.03-0.12微克,0.06微克/毫升的明确模式的MIC。在MIC结果由于方法差A轻微变化,除了在±一个稀释的固有骨密度变化,有可能对敏感率一个显著影响。6类似的脂糖肽类药物,达巴万星药敏试验可以是作为结果有挑战性的溶解度和分子的相对大的尺寸和它的结合特性7,8,9。这里所描述的参考骨密度方法包括所特有的不溶性活性剂和/或脂糖肽类药物两个特定步骤:(1)使用DMSO制备储备溶液和(2)加入0.002%的P-80在最终的MIC面板稀释液。此视频出版物的目的是提供清晰度达巴万星骨密度的方法和到的specificaLLY关注这些关键步骤,以确保精确和可重复的MIC结果。
备战万星MIC测试时,下列方法的细节提出了额外的考虑。将MIC面板的设计将取决于待测试的抗微生物剂的数量(即,单独或多个代理达巴万星)和细菌的物种进行测试。达巴万星浓度应包括解释断点预期为至少一个的QC应变所有细菌物种进行测试和稀释的整个范围。抗微生物稀释系列可以组织或者行或列中取决于抗微生物剂和/或隔离/板和接种的方法的数量。达巴万星粉末和培养液的体积应计算,以确保最佳量产生和浪费是最小的。对于本出版物中使用的示例中,卷的基础上编制两次MIC板。阳离子调节的Mueller Hinton肉汤应根据人准备和灭菌ufacturer的指示和媒体的无菌验证。 MIC板可以制成和制备当天使用,或者它们可以通过适当的质量控制生物体和供将来使用冷冻贮存的验证板进行测试。在整个过程中使用无菌技术是重要的。
没有严格的标准验证接种浓度与菌落计数。菌落计数最初可以检查测试和/或周期性地验证在步骤4.2进行稀释步骤每一物种。重要的是,在0.5麦克法兰标准的有效性还检查例行与 E. 大肠杆菌 ATCC 25922使用类似于一个过程到步骤4.5。如果结果不等于1-2×10 8 CFU / ml的,一个新的0.5麦克法兰标准应获得。如果从MIC井菌落计数的可接受范围之外(2-8×10 5 CFU /毫升和MIC结果的临床分离群从第变化Ë预期正态分布(如0.03-0.12微克/毫升为金黄色葡萄球菌 )和/或MIC结果质量控制分离物(S)的预期范围之外,验证测试是必要的,方法的修改可能需要进行。有人建议,一个验证0.5麦法兰标准来重复菌落计数(多个),如果结果是再次预期结果之外,如在步骤4.2进行的接种物稀释应作相应的调整和MIC重复。需要注意的是即使进行菌落计数因为菌落计数过程使用稀释体积可能不一定检测较低污染微生物的浓度的纯度检查是必要的。
对于MIC试验被认为是有效的,可接受的增长必须发生在生长控制良好。对于大多数的细菌,将针对达巴万星进行测试(即,葡萄球菌,链球菌和肠球菌,生长将被看作是一个按钮(通常> 2毫米)和更少的FRequently,增长可能会出现浑浊的好。不像一些抗菌剂可能会出现拖尾的效果浓度增加,万星端点通常很好的定义。还有为了便于阅读微稀释试验各种观看设备,其可以被用来读取达巴万星含有平板只要有在辨别生长在孔中的能力没有妥协。
在协议中的关键步骤涉及的程序与相关的达巴万星和加成P80的溶解度的部分。重要的是,达巴万星的使用的最大浓度不大于1600微克/毫升,使DMSO正在使肉汤稀释之前用作溶剂和中间体的浓度在DMSO中制备,使DMSO在MIC中的最终浓度面板的孔是不大于1%。 DMSO是吸湿,因此,利用旧的瓶的DMSO是一个的体贴离子关于达巴万星的溶解度。然而,在质量控制株小BMD研究表明这并非是一个重要的变量(见结果部分),它是使用新的或近期开瓶DMSO的好习惯。它也是重要的P80被添加到肉汤中稀释药物制剂的最后步骤,是在0.002%在MIC的最终浓度良好。
包括骨密度过程这里利用以及在达巴万星和P-80的浓度的终浓度2倍和相加接种物用50μl/孔,使得最终体积/孔为100微升制备用50微升/ MIC板。这种方法允许一个MIC面板的格式产生两个S的测试金黄色葡萄球菌和肺炎因为溶解的马血中可加入到接种物。使用100μl/孔并加入到10微升的其它方法制备的MIC板/孔中被描述CLSI和ISO程序。
在万星敏感断点S.金黄色葡萄球菌是≤0.12微克/毫升(FDA药品说明书)。如示于最近的监视,大多数菌株是由达巴万星在0.06微克/毫升15个级别的抑制。随着易感断点接近模态MIC在MIC的方法不同造成的任何变化都会影响敏感率。因为BMD程序达巴万星,包括一些独特的步骤(具体地说,在在MIC中以及制备的库存和中间药物稀释和0.002%P80的使用DMSO,当务之急是,该方法是完全遵循的金黄色葡萄球菌的QC生物体(ATCC 29213)与0.06微克/毫升的很清楚达巴万星MIC模态,一直方法变化的良好指标和应常规用于验证骨密度方法。如果MIC结果与0.03-0.12微克预期范围/毫升,但趋向于任一低或HIG此范围H侧,该方法的进一步的验证是必要的。
加入0.002%P80的被推荐用于所有相关的革兰氏阳性生物体(staphylococcci,肠球菌,和链球菌)。然而,值得注意的是,它已经表明,溶解的马血的作用类似于P-80相对于它的抗结合能力和,加入的P-80,以CAMHB + LHB对达巴万星MIC链球菌结果没有额外的影响。
目前尚没有纸片法进行测试达巴万星和由于骨密度的相关性差和AD的结果,使用AD方法达巴万星的敏感性测试,不推荐12,14。骨密度方法应当用于达巴万星的敏感性的未来的评估而作为金标准的商业药敏试验的发展。
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |