Измерение повреждения и восстановления ДНК в мышиных спленоцитах После Хронический<em> В Vivo</em> Воздействие Очень низкие дозы бета- и гамма-излучения
Summary
A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.
Abstract
Низкая доза облучения радиации может производить различные биологические эффекты, которые отличаются по количеству и качеству от эффектов, вызываемых высокими дозами радиации. Обращаясь вопросы, связанные с безопасностью окружающей среды, охраны труда и здравоохранения в правильной и научно обоснованного образом в значительной степени зависит от способности точно измерять биологические эффекты малых доз загрязняющих веществ, таких как ионизирующее излучение и химические вещества. Повреждения и репарации ДНК являются наиболее важными первые признаки рисков для здоровья из-за их потенциальных последствий долгосрочных, таких как рак. Здесь мы опишем протокол для изучения влияния хронический естественных воздействия низких доз γ- и β-излучения на повреждения ДНК и ремонт в мышиных клеток селезенки. Использование общепринятого маркер ДНК двунитевых разрывов, фосфорилируется гистонов Н2АХ называется γH2AX мы покажем, как он может быть использован для оценки не только уровни повреждения ДНК, но также изменяетв ремонт мощностью ДНК потенциально производится низкой дозе облучения в естественных условиях. Проточная цитометрия позволяет быстро, точно и надежно измерить immunofluorescently меченого γH2AX в большом количестве образцов. ДНК двухцепочечной ремонта разрыв может быть оценена путем воздействия извлеченные спленоцитов к радикальной дозы 2 Гр для получения достаточного количества разрывов ДНК, чтобы вызвать восстановление, а путем измерения индуцированного (1 ч после облучения) и остаточный повреждение ДНК (24 часов после облучения). Остаточная повреждение ДНК будет свидетельствовать о неполном ремонта и риск долгосрочного геномной нестабильности и рака. В сочетании с другими анализами и конечных точек, которые могут быть легко измерены в например в естественных условиях исследования (например, хромосомные аберрации, микроядра частот в ретикулоцитов костного мозга, экспрессии генов и т.п.), этот подход позволяет точно и контекстную оценку биологических эффектов стрессоров низком уровне.
Introduction
Значительное Споры о возможном вредном воздействии низкой или очень низких дозах ионизирующего излучения и страх общественности излучения, что обусловлено изображений атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки и редких аварий атомных станций (усугубляется массовой информации), привело к очень строгое регулирование радиационной защиты и стандарты, которые потенциально не научно обоснованным. В течение последних трех десятилетий, многочисленные доклады документально как отсутствие вредных и наличие потенциально полезных биологических эффектов, вызванных низкой дозой излучения 1-4. Основным фактором риска радиационного здоровье вероятность рака, по оценкам на основе эпидемиологических исследований переживших атомные бомбы, получающих высокие или средние дозы радиации. Линейной экстраполяции этих данных (так называемых не-линейное нет порога или LNT модель) используется для оценки рисков рака при низких дозах. Тем не менее, этот подход не получил мировую научную принятиеи сильно обсуждается 5.
Очевидно, что больше исследования необходимы, чтобы прояснить этот вопрос и, возможно, улучшить стандарты радиационной защиты. Такие исследования должны включать хронические процедуры (наилучшее приближение экологических и профессиональных рисков), в естественных условиях на животных моделях (лучше для экстраполяции эффектов к человеку) и такие конечные точки, как уровень повреждений ДНК, ремонт ДНК и мутагенеза. Известно, что ДНК основной мишенью для повреждения радиационных эффектов и неполным или неправильно ремонт может привести к мутагенеза и рака развития 6.
ДНК двухцепочечной разрывы (DSB) являются одним из самых вредных видов повреждений ДНК и может привести к гибели клеток и онкогенеза 7. Поэтому, важно, чтобы иметь возможность надежно и точно измерить уровень DSB после воздействия малых доз радиации и / или других факторов стресса, таких как химических загрязнителей. Одним из наиболее чувствительных и специфических маркеровДНК DSB фосфорилируется гистонов Н2АХ, называется γH2AX 8, пока другие маркеры и методы были предложены 9,10. Считается, что тысячи молекул H2AX, в непосредственной близости от индуцированного DSB, которые участвуют в формировании благоприятной γH2AX обнаружение индивидуального DSB по иммунофлуоресцентного маркировки с антителом и флуоресцентной микроскопии анти-γH2AX 11. Ответ очень быстро, достигая максимума между 30 и 60 мин. Существуют доказательства того, что γH2AX облегчает ремонт ДНК DSB путем привлечения других факторов ремонт на сайты разрывов и изменения структуры хроматина, чтобы закрепить концы сломанной ДНК и обеспечить доступ для других белков ремонт (рассмотренных в 12). После завершения ремонта ДНК DSB, γH2AX получает де-фосфорилируется и / или подвергается деградации, и вновь синтезированные молекулы H2AX заменить γH2AX в пострадавших районах хроматина 10. Формирование и потери γH2AX Мониторинг может,Поэтому, обеспечивают точную оценку ДНК DSB ремонт кинетики. Этот подход был использован для изучения ремонт DSB в различных линий опухолевых клеток человека, облученных высокими дозами радиации и ее скорости и остаточных уровней DSB, как было показано, коррелирует с радиочувствительности 13-15.
Мы изменили эту экспериментальный подход и применять его в естественных условиях в исследовании мыши, чтобы изучить влияние малых доз хронического γ- и β-облучения на уровнях и ремонта (рис 1) ДНК DSB. Во-первых, мы продемонстрировать способ для выполнения долгосрочного Хроническое воздействие мышей с β-излучение, испускаемое либо тритий (водород-3) в виде тритием воды (НТО), либо как органически связанный тритий (ОСТ), растворенного в питьевой воде , Эти две формы, как ожидается, накапливать и / или распространение по-разному в организме и, следовательно, производить различные биологические эффекты. Обе формы потенциальные опасности в ядерной промышленности. Это лечениеидет параллельно с хроническим воздействием γ-излучения при эквивалентной дозы, чтобы правильно сравнение двух типов излучения, которая имеет решающее значение для оценки их относительной биологической эффективности. Бета-излучение состоит из электронов, что делает его очень отличается от γ-излучения высокой энергии фотонов. Из-за этой разницы, Β-излучение представляет основном внутреннюю опасность для здоровья и может производить различные биологические эффекты по сравнению с γ-излучения. Это осложнение привело к значительным споры по поводу регулирования воздействия β-излучения, испускаемого НТО. Таким образом, нормативные уровни НТО в питьевой воде для населения варьируется от 100 Бк / л в Европе 75 000 Бк / л в Австралии. Поэтому, важно, чтобы сравнить биологические эффекты НТО в эквивалентных дозах γ-излучения. Во-вторых, скорость ДНК DSB измеряется в изолированных спленоцитов после завершения хронического облучения с помощью immunofluorescently помечены γH2AX обнаружитьред с помощью проточной цитометрии. Это позволяет оценить степень повреждения ДНК, нанесенные в естественных воздействий. Тем не менее, это разумно ожидать, что такие риски низкого уровня не может производить какие-либо обнаруживаемых ставки ДНК DSB; вместо этого, некоторые скрытые изменения / ответы можно ожидать, что будет влиять на способность клеток к репарации повреждений ДНК. Эти изменения, если он найден, может быть либо стимулирующий (производить благоприятное воздействие) или ингибирующее (производство вредное воздействие). Предложенный протокол позволяет выявить такие изменения, бросая вызов извлеченные спленоцитов с высокой дозой радиации, который производит значительное количество повреждений (например, 2 Гр производству примерно 50 ДНК DSB на ячейку или 3 -. Увеличение 5 раза в общей уровне γH2AX) , Впоследствии, формирование и потеря γH2AX, отражающие начала и завершения ремонта DSB, контролируется с помощью проточной цитометрии. Таким образом, не только базальную и вызванных лечением уровни ДНК DSB могут быть измерены, ноТакже его потенциальный эффект от способности клеток реагировать и ремонта повреждений ДНК, вызванных гораздо более высоких уровнях стрессорных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные в этой статье, является полезным для проведения масштабного мышь в естественных условиях исследований, посвященных Генотоксического эффекты низких уровней различных химических и физических агентов, в том числе ионизирующего излучения. Наш уникальный к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).
Materials
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1mg/mL |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm mL uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60x15mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10X Stock, | |||
| 30g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
