만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em> 생체</em> 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출
Summary
A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.
Abstract
저용량 방사선 노출은 높은 방사선 량에 의해 생성 효과에서 수량과 품질이 상이한 생물학적 효과의 다양성을 생성 할 수있다. 적절한 과학적으로 정당화 방식으로, 환경 산업 및 공중 보건 안전과 관련된 질문을 해결하는 것은 크게 정확하게 방사선 및 화학 물질을 이온화 낮은 복용량 오염 물질의 생물학적 효과를 측정 할 수있는 능력에 의존한다. DNA 손상 및 수리로 인해 암과 같은 잠재적 인 장기 결과에 건강 위험의 가장 중요한 초기 지표입니다. 여기에서 우리는 마우스의 비장 세포에서 DNA 손상 수리 및 γ-와 β-방사선의 낮은 복용량에 생체 노출 만성의 효과를 연구 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. DNA 이중 가닥 나누기 일반적으로 받아 들여지는 마커를 사용하여, γH2AX라는 인산화 히스톤 H2AX, 우리는 DNA 손상뿐만 아니라 레벨을 평가하는 데 사용될 수있는 방법을 설명하지만,도 변화DNA 복구 능력에 잠재적으로 생체 내 노출의 저용량에 의해 생산. 많은 수의 샘플에 표지 immunofluorescently γH2AX의 빠르고 정확하고 신뢰성있게 측정 계측법 흐른다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리는 (DNA 수리를 트리거 쉬는 충분한 수를 생성하기 위해 2 Gy의의 도전 량 추출 비장 세포를 노출시킴으로써 및 유도 (1 시간 조사 후) 잔류 DNA 손상을 측정함으로써, 24 시간을 평가할 수있다 사후 조사). 잔류 DNA 손상은 불완전한 복구 및 장기 게놈 불안정성과 암의 위험을 나타내는 것이다. 용이하게 생체 내 연구 (예를 들면, 염색체 수차 골수 망상 적혈구의 소핵 주파수, 유전자 발현, 등) 등으로 측정 할 수있는 다른 분석 및 종점과 결합하여,이 방법은 생물학적 효과의 정확한 상황 평가할 수있다 낮은 수준의 스트레스.
Introduction
(매스 미디어에 의해 악화) 방사선 히로시마와 나가사키 원자 폭탄의 희귀 원자력 발전소 사고의 이미지에 의해 구동 방사선 대중의 공포를, 이온화 낮거나 매우 낮은 용량 중 하나의 잠재적 인 해로운 영향에 비해 상당한 논쟁에 주도하고있다 매우 엄격한 방사선 방호 규제와 잠재적으로 과학적으로 정당하지 않은 기준. 지난 30 년에, 다수의 보고서는 유해의 부족과 낮은 선량 방사선 1-4에 의한 잠재적으로 유익한 생물 효과의 존재를 모두 기록했다. 주요 방사선 건강 위험 요인은 방사선의 높은 또는 중간 용량을 수신 원자 폭탄 생존자의 역학 연구에 기초하여 추정 암의 확률이다. (그래서 선형 노 임계 값 또는 LNT 모델 호출되지) 이러한 데이터의 선형 외삽은 낮은 용량에서 암의 위험을 추정하는 데 사용됩니다. 그러나,이 접근법은 세계적 과학 수용을받지 못한무겁게 5를 논의한다.
그것은 더 연구가이 문제를 명확히하고 아마도 방사선 보호 기준을 개선하는 데 필요한 것이 명백하다. 이러한 연구는 DNA 손상 비율, DNA 수리 및 돌연변이 유발 등과 같은 엔드 포인트 (인간에 효과를 외삽을 위해 최선을) 생체 내 동물 모델에서 만성 치료 (환경 적, 직업적 노출의 가장 근사치)를 포함한다. 그것은 DNA가 돌연변이와 암 개발 (6)으로 이어질 수 방사선 효과와 불완전하거나 잘못된 수리 손상의 기본 목표 것으로 알려져있다.
DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 DNA 병변의 가장 해로운 유형 중 하나이며, 세포 사멸 및 종양 7 발생할 수 있습니다. 이는, 따라서, 중요한 확실하고 정확하게 저용량 방사선 및 / 또는 화학 물질과 같은 다른 오염물 스트레스에 노출 된 후 DSB의 수준을 측정 할 수 있어야한다. 가장 민감하고 특이 마커의 한DNA DSB의 γH2AX 8라는 인산화 히스톤 H2AX이며, 또 다른 마커 및 방법은 9,10 제안되었다. 그것은 H2AX 분자 수천, 유도 DSB의 근방에, 안티 γH2AX 항체 및 형광 현미경 (11)에 의한 면역 형광 라벨링 개별 DSB의 검출을 가능 γH2AX의 형성에 관여하는 것으로 추정된다. 반응은 최소 30 내지 60의 최대 도달 매우 빠르다. 증거 γH2AX 나누기의 사이트에 다른 수리 요소를 유치 및 깨진 DNA의 끝을 고정하고 (12에서 검토) 다른 수리 단백질에 대한 액세스를 제공하기 위해 크로 마틴 구조를 수정하여 DNA DSB의 수리를 용이하게하는 것이 존재한다. DNA DSB의 수리가 완료되면, γH2AX은 인산화 해제 및 / 또는 저하를 거쳐, 새로 합성 H2AX 분자는 크로 마틴 (10)의 영향을받는 지역에 γH2AX 교체됩니다. γH2AX의 형성과 손실을 모니터링 할 수 있습니다,따라서, DNA 복구 DSB 동력학의 정확한 추정치를 제공한다. 이 방법은 방사선 감수성 13-15과 상관하는 것으로 나타났다 방사선 및 그 잔류 율 및 DSB 레벨 고용량 조사 다양한 인간 종양 세포주에서 DSB 수리를 연구하기 위해 사용되었다.
우리는이 실험적인 접근 방식을 수정 DNA DSB 수준 및 수리 (그림 1)에 만성 γ-와 β-조사의 낮은 용량의 영향을 조사하기위한 생체 내 마우스 연구에 적용했다. 첫째, 우리는 마시는 물에 용해 β-방사선 삼중 물 (HTO)의 형태로 하나의 삼중 수소에 의해 방출 (수소 3) 또는 유기적으로 결합 된 삼중 수소 (OBT) 마우스의 장기 만성 노출을 수행하는 방법을 보여 . 두 형태의 축적 및 / 또는 다른 신체에 따라서 분배, 상이한 생물학적 효과를 생성 할 것으로 예상된다. 두 형태의 원자력 산업에 잠재적 인 위험이 있습니다. 이 치료상대적인 생물학적 효능의 평가를 위해 중요하다 방사선 두 종류의 정확한 비교를 할 수 있도록 상응하는 투여 율 γ-만성 방사선에 노출 병행된다. 베타 방사선 γ 방사선, 고 에너지 광자에서 매우 상이한하게 전자 구성된다. 이 때문에 차이로 Β-방사선은 주로 내부 건강 위험을 나타내며, γ-방사선을 비교하여 서로 다른 생물학적 효과를 생성 할 수있다. 이 합병증은 β-방사선에 HTO에 의해 방출을 노출의 규제에 비해 상당한 논쟁의 결과. 따라서, 공공 식수에 HTO의 규제 수준은 유럽에서 100 BQ / L에서 호주에서 75,000 BQ / L로 변화한다. 또한 γ-방사선의 선량 당량 HTO의 생물학적 효과를 비교하는 것이 중요하다. 둘째, DNA DSB의 속도는 immunofluorescently 감지 γH2AX 표시하여 만성 노출의 완료에 고립 된 비장 세포에서 측정유동 세포 계측법에 의해 에드. 이는 생체 내 노출에 의해 가해진 DNA 손상의 정도를 평가할 수있다. 그러나, 이러한 낮은 수준의 노출이 DNA 중 어느 DSB 검출 속도를 얻지 못할 수 있다는 기대 분별이고; 대신, 숨겨진 변경 / 응답은 DNA 손상을 복구하는 세포의 능력에 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다. 이러한 변화는, 발견하는 경우가 될 수도 있고 자극 (해로운 효과를 생산) (유익한 효과를 생산) 또는 억제. 제안 된 프로토콜은 손상의 상당한 양의 생산 방사선의 고용량으로 추출 비장 도전하여 그러한 변경을 드러내는 허용 (예를 들어, 2 Gy의 약 50 셀당 DNA DSB 또는 3의 제조 -. 총 γH2AX 레벨의 5 배 증가) . 그 후, DSB 수리의 시작과 완료를 반영 형성과 γH2AX의 손실, 유동 세포 계측법에 의해 감시된다. 이러한 방식으로, 기저 및 DNA DSB의 치료 – 유도 수준뿐만 아니라 측정 될 수 있지만,또한 세포의 기능에 미치는 잠재적 인 효과가 응답하고 수리 DNA 손상이 훨씬 더 높은 스트레스 수준에 의해 유도.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 제시된 프로토콜은 전리 방사선 등 다양한 화학적, 물리적 에이전트의 낮은 수준의 유전 독성 효과를 조사 생체 내 연구에 대규모 마우스를 수행하는 데 유용합니다. 우리 고유의 무균 동물 시설은 GammaBeam 150 조사 장치를 장착하고 30 미터 길이의 조사 홀은 수백 또는 마우스의 수천에 낮거나 매우 낮은 선량률 조사되어 관련된 평생 연구를 수행 할 수 있습니다. 만성 저용량 조사…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).
Materials
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1mg/mL |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm mL uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60x15mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10X Stock, | |||
| 30g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
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