Mesure de dommages et réparation de l'ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em> In Vivo</em> L'exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement
Summary
A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.
Abstract
L'exposition aux rayonnements à faible dose peut produire une variété d'effets biologiques qui sont différentes en quantité et de la qualité des effets produits par de fortes doses de rayonnement. Aborder les questions relatives à la sécurité de la santé environnementale, professionnelle et publique d'une manière appropriée et justifiée scientifiquement repose largement sur la capacité de mesurer avec précision les effets biologiques des polluants à faible dose, tels que des substances chimiques et des rayonnements ionisants. dommages à l'ADN et la réparation sont les plus importants indicateurs précoces de risques pour la santé en raison de leurs conséquences à long terme potentiels, tels que le cancer. Ici, nous décrivons un protocole pour étudier l'effet de l'exposition in vivo chronique à de faibles doses de γ- et β-rayonnement sur les dommages de l'ADN et la réparation dans les cellules de rate de souris. En utilisant un marqueur couramment acceptée de cassures de l'ADN double-brin, phosphorylée H2AX histone appelé γH2AX, nous démontrons comment il peut être utilisé pour évaluer non seulement les niveaux de dommages à l'ADN, mais change ausside la capacité de réparation de l'ADN potentiellement produite par une faible dose de l'exposition in vivo. La cytométrie en flux permet une mesure rapide, précise et fiable des immunofluorescence marqué γH2AX dans un grand nombre d'échantillons. ADN double-brin de réparation des cassures peut être évaluée en exposant splénocytes extraites à une dose stimulante de 2 Gy pour produire un nombre suffisant de cassures de l'ADN pour déclencher la réparation et en mesurant l'induit (1 h post-irradiation) et les dommages de l'ADN résiduel (24 heures post-irradiation). Lésions de l'ADN résiduel serait indicative de réparation incomplète et le risque d'instabilité génomique à long terme et le cancer. Combiné avec d'autres analyses et points d'extrémité qui peuvent être facilement mesurés dans cette étude in vivo (par exemple, des aberrations chromosomiques, des fréquences de micronoyaux dans les réticulocytes de la moelle osseuse, l'expression des gènes, etc.), cette approche permet une évaluation précise et contextuelle des effets biologiques de facteurs de stress de bas niveau.
Introduction
Une importante controverse sur les effets nocifs potentiels de doses soit faibles ou très faibles de rayonnement et de la peur de publique de rayonnement, tirée par les images des bombardements atomiques d'Hiroshima et de Nagasaki et de rares accidents de centrales nucléaires ionisants (exacerbée par les médias de masse), a conduit à de très la réglementation et les normes qui sont potentiellement pas scientifiquement justifiée radioprotection stricte. Au cours des trois dernières décennies, de nombreux rapports ont documenté à la fois l'absence de nuisibles et la présence d'effets biologiques potentiellement bénéfiques induits par une faible dose rayonnement 1-4. Le principal facteur de risque pour la santé de rayonnement est la probabilité de cancer, estimé sur la base des études épidémiologiques des survivants de la bombe atomique recevant des doses élevées ou moyennes de rayonnement. Extrapolation linéaire de ces données (dites linéaire sans seuil ou modèle LNT) est utilisé pour estimer les risques de cancer à faibles doses. Cependant, cette approche n'a pas reçu l'acceptation scientifique mondialet est fortement débattue 5.
Il est évident que d'autres études sont nécessaires pour clarifier cette question et peut-être améliorer les normes de radioprotection. Ces études devraient impliquer des traitements chroniques (meilleur rapprochement des expositions environnementales et professionnelles), dans des modèles animaux in vivo (meilleure pour les effets pour la santé humaine) et en extrapolant ces points extrêmes que les taux de lésions de l'ADN, réparation de l'ADN et la mutagénèse. Il est connu que l'ADN est la cible principale pour endommager les effets des rayonnements et incomplètes ou mal-réparation peut conduire à la mutagenèse et le développement du cancer 6.
Cassures double-brin d'ADN (ORD) sont l'un des types les plus délétères de lésions de l'ADN et peuvent conduire à la mort cellulaire et la tumorigenèse 7. Il est donc important de pouvoir mesurer de manière fiable et précise le niveau de l'ORD après l'exposition au rayonnement à faible dose et / ou d'autres facteurs de stress, tels que les polluants chimiques. L'un des marqueurs les plus sensibles et spécifiquesde l'ADN DSB histone H2AX phosphorylée est appelé γH2AX 8, mais d'autres marqueurs et procédés ont été suggérés 9,10. On estime que des milliers de molécules d'H2AX, dans le voisinage d'un ORD induite, sont impliqués dans la formation de γH2AX permettant la détection de l'individu ORD par marquage immunofluorescent avec un anticorps et la microscopie à fluorescence anti-γH2AX 11. La réaction est très rapide, atteignant son maximum entre 30 et 60 min. Il existe des preuves que γH2AX facilite la réparation de l'ADN de l'ORD en attirant d'autres facteurs de réparation des sites de pauses et en modifiant la structure de la chromatine pour ancrer extrémités d'ADN cassées et fournir un accès à d'autres protéines de réparation (12) examinés dans. À la fin de la réparation de l'ADN de l'ORD, γH2AX se dé-phosphorylée et / ou subit une dégradation, et des molécules d'H2AX nouvellement synthétisées remplacer γH2AX dans les zones touchées de la chromatine 10. La formation et la perte de γH2AX surveillance peut,par conséquent, fournir une estimation précise de l'ADN de l'ORD cinétique de réparation. Cette approche a été utilisée pour étudier la réparation de l'ORD dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines irradiées avec des doses élevées de niveaux résiduels ORD rayonnement et son taux et ont été corrélée à la radiosensibilité 13-15.
Nous avons modifié cette approche expérimentale et appliquée à une étude in vivo de la souris pour examiner les effets des faibles doses de γ- chronique et β-irradiation sur les niveaux d'ADN de l'ORD et la réparation (Figure 1). Tout d'abord, nous démontrons une méthode pour effectuer une exposition chronique à long terme des souris à β-rayonnement soit émis par le tritium (hydrogène 3) sous la forme d'eau tritiée (HTO) ou que le tritium lié organiquement (OBT) dissous dans l'eau potable . Les deux formes sont attendus pour accumuler et / ou distribuer différemment dans le corps et, par conséquent, de produire différents effets biologiques. Les deux formes sont les dangers potentiels dans l'industrie nucléaire. Ce traitementva de pair avec une exposition chronique à γ-rayonnement à un débit de dose équivalente pour permettre une comparaison correcte des deux types de rayonnement, qui est crucial pour l'évaluation de leur efficacité biologique relative. Le bêta-rayonnement est constitué d'électrons, ce qui rend très différente de la γ-rayonnement, les photons de haute énergie. En raison de cette différence, Β-rayonnement représente danger pour la santé essentiellement interne et peut produire des effets biologiques différents par rapport à γ-rayonnement. Cette complication a donné lieu à des controverses importantes sur la réglementation de l'exposition à la β-rayonnement émis par HTO. Ainsi, les niveaux réglementaires de HTO dans l'eau potable pour le public varient de 100 Bq / L en Europe à 75.000 Bq / L en Australie. Il est donc important de comparer les effets biologiques de HTO à des doses équivalentes de γ-irradiation. Deuxièmement, le taux de l'ADN de l'ORD est mesurée dans les splénocytes isolés lors de l'achèvement des expositions chroniques à l'aide immunofluorescence marqué γH2AX détectered par cytométrie de flux. Ceci permet l'évaluation de l'importance des dégâts infligés par les ADN exposition in vivo. Cependant, il est raisonnable de s'attendre à ce que de telles expositions de bas niveau ne peuvent pas produire des taux détectables d'ADN ORD; à la place, quelques changements cachés / réponses peuvent être attendus qui pourraient affecter la capacité des cellules à réparer les dommages de l'ADN. Ces changements, si trouvé, peuvent être soit de stimulation (produisant un effet bénéfique) ou inhibiteur (produisant un effet délétère). Le protocole proposé permet de révéler de tels changements en contestant les splénocytes extraites avec une forte dose de rayonnement qui produit une quantité importante de dommages (par exemple, 2 Gy produisant environ 50 ADN ORD par cellule ou d'un 3 -. Augmentation de 5 fois dans le niveau de γH2AX totale) . Par la suite, la formation et la perte de γH2AX, reflétant l'initiation et l'achèvement de la réparation DSB, est surveillée par cytométrie de flux. De cette façon, non seulement de base et des niveaux d'ADN ORD induites par le traitement peuvent être mesurés, maisaussi son effet potentiel sur la capacité des cellules à répondre et les dommages de réparation de l'ADN induite par des taux de stress beaucoup plus élevés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté dans ce document est utile pour la réalisation à grande échelle de la souris dans les études in vivo portant sur les effets génotoxiques des faibles niveaux de divers agents chimiques et physiques, y compris les rayonnements ionisants. Notre installation unique et spécifique des animaux exempts de pathogènes équipé d'un irradiateur GammaBeam 150 et une salle d'irradiation longue de 30 mètres permet la réalisation d'études long de la vie impliquant d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).
Materials
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1mg/mL |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm mL uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60x15mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10X Stock, | |||
| 30g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
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