قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em> في فيفو</em> التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية
Summary
A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.
Abstract
انخفاض جرعة التعرض للإشعاع قد تنتج مجموعة متنوعة من الآثار البيولوجية التي تختلف في كمية ونوعية من الآثار التي تنتجها جرعات عالية من الإشعاع. معالجة المسائل المتعلقة بالسلامة والصحة البيئية والمهنية والعامة بطريقة سليمة ومبررة علميا يعتمد بشكل كبير على القدرة على قياس دقيق لآثار البيولوجية للملوثات جرعة منخفضة، مثل المؤينة المواد الإشعاعية والكيميائية. الضرر وإصلاح الحمض النووي هي مؤشرات مبكرة أهم المخاطر الصحية بسبب العواقب على المدى الطويل المحتملة، مثل السرطان. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة تأثير التعرض المزمن في الجسم الحي لجرعات منخفضة من γ- وβ-الإشعاع على الحمض النووي من التلف وإصلاح في خلايا الطحال الماوس. باستخدام علامة مقبولة عموما من الحمض النووي الكسر مزدوج الحبل، مفسفر H2AX هيستون دعا γH2AX، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط على مستوى الحمض النووي من التلف، ولكن التغييرات أيضافي قدرة إصلاح الحمض النووي المنتجة يحتمل بجرعة منخفضة في التعرض الجسم الحي. التدفق الخلوي يسمح قياس سريعة ودقيقة وموثوق بها من المسمى immunofluorescently γH2AX في عدد كبير من العينات. يمكن تقييم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر من خلال تعريض splenocytes استخراج إلى جرعة الصعبة من 2 غراي لإنتاج عدد كاف من DNA فواصل لتحريك إصلاح وعن طريق قياس يسببها (1 ساعة بعد التشعيع) والحمض النووي من التلف المتبقية (24 ساعة بعد التشعيع). أن الحمض النووي من التلف المتبقي يكون مؤشرا على إصلاح ناقصة وخطر عدم الاستقرار الجيني على المدى الطويل والسرطان. جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى ونقطة النهاية التي يمكن بسهولة أن يقاس في مثل هذه الدراسات المجراة (على سبيل المثال، التشوهات الكروموسومية، ترددات النويات في الشبكيات نخاع العظام، والتعبير الجيني، وما إلى ذلك)، وهذا النهج يتيح إجراء تقييم دقيق والسياقية للآثار البيولوجية من الضغوطات مستوى منخفض.
Introduction
جدل كبير بشأن الآثار الضارة المحتملة من تناول جرعات منخفضة أو منخفضة جدا من الإشعاع والخوف الجمهور من الإشعاع، مدفوعا صورا للتفجيرات الذرية هيروشيما وناغازاكي والنادرة الحوادث محطة نووية المؤينة (التي تفاقمت بسبب وسائل الإعلام)، قد أدى إلى غاية تنظيم الحماية من الإشعاع الصارم والمعايير التي يمكن أن تكون غير مبررة علميا. في العقود الثلاثة الماضية، وقد وثقت تقارير عديدة سواء لعدم وجود ضارة وجود الآثار البيولوجية يمكن أن تكون مفيدة الناجمة عن الإشعاع جرعة منخفضة 1-4. عوامل الخطر الصحية للإشعاع الرئيسي هو احتمال السرطان، تقديرها بناء على دراسات وبائية من الناجين من القنبلة الذرية تلقي جرعات عالية أو متوسطة من الإشعاع. يستخدم الخطية استقراء هذه البيانات (ما يسمى خطية أي عتبة أو نموذج LNT) لتقدير مخاطر الإصابة بسرطان بجرعات منخفضة. ومع ذلك، لم تتلق هذا النهج القبول العلمي على مستوى العالموناقش بشكل كبير 5.
ومن الواضح أن هناك حاجة لمزيد من الدراسات لتوضيح هذه المسألة، وربما تحسين مستويات الحماية من الإشعاع. وينبغي أن تشمل هذه الدراسات العلاجات المزمنة (أفضل تقريب التعرض للعوامل البيئية والمهنية)، في النماذج الحيوانية الجسم الحي (أفضل لاستقراء آثار للإنسان) وهذه النقاط النهائية عن معدلات الحمض النووي من التلف، وإصلاح الحمض النووي والطفرات. ومن المعروف أن الحمض النووي هو الهدف الرئيسي لإتلاف آثار الإشعاع وغير مكتملة أو سوء إصلاح قد يؤدي إلى الطفرات والسرطان تطوير 6.
DNA الكسر مزدوج الحبل (DSB) هي واحدة من أكثر أنواع ضارة من آفات الحمض النووي وربما تؤدي إلى موت الخلايا وتكون الأورام 7. ولذلك، من المهم أن تكون قادرة على موثوق ودقيق قياس مستوى DSB بعد التعرض لجرعة منخفضة من الإشعاع و / أو غيرها من الإجهاد، مثل الملوثات الكيميائية. واحدة من علامات الأكثر حساسية ومحددةمن الحمض النووي DSB غير فسفرته هيستون H2AX، ودعا γH2AX 8، ولكن قد اقترحت علامات وغيرها من الأساليب 9،10. وتشير التقديرات إلى أن الآلاف من جزيئات H2AX، في المنطقة المجاورة لجهاز تسوية المنازعات التي يسببها، ويشارك في تشكيل γH2AX تمكين الكشف عن الفردية DSB التي وصفها مناعي مع مضاد للγH2AX الأجسام المضادة ومضان المجهر 11. كانت الاستجابة سريعة جدا، حيث بلغ حده الأقصى بين 30 و 60 دقيقة. يوجد دليل على أن γH2AX يسهل إصلاح الحمض النووي DSB من خلال جذب عوامل تصليح أخرى إلى مواقع فواصل، وتعديل هيكل لونين لترسيخ نهايات الحمض النووي مكسورة وتوفير إمكانية الوصول للبروتينات تصليح أخرى (إعادة النظر في 12). عند الانتهاء من إصلاح الحمض النووي DSB، ويحصل على γH2AX إلغاء فسفرته و / أو يخضع لتدهور، والجزيئات H2AX مركبة جديدة تحل محل γH2AX في المناطق المتضررة من لونين 10. رصد تشكيل وفقدان γH2AX يمكن،لذلك، تقديم تقدير دقيق للDNA DSB حركية الإصلاح. وقد استخدم هذا النهج لدراسة إصلاح جهاز تسوية المنازعات في مختلف خطوط الخلايا السرطانية البشرية المشع مع جرعات عالية من الإشعاع ومعدل ومستويات DSB المتبقية وقد ثبت للربط مع حساسية للأشعة 13-15.
نحن تعديل هذا المنهج التجريبي وتطبيقه على دراسة الماوس في الجسم الحي لدراسة آثار الجرعات المنخفضة من γ- المزمنة وβ-التشعيع على مستويات الحمض النووي DSB و إصلاحها (الشكل 1). أولا، علينا أن نظهر وسيلة لإجراء التعرض على المدى الطويل المزمن من الفئران إلى β-الإشعاعات المنبعثة إما عن طريق التريتيوم (هيدروجين 3) في شكل الماء معالج بالتريتيوم (HTO) أو التريتيوم ملزمة عضويا (OBT) الذائب في مياه الشرب . ومن المتوقع أن تتراكم و / أو توزيع مختلف في الجسم، وبالتالي، تنتج تأثيرات بيولوجية مختلفة الأشكال اثنين. كلا الشكلين هي الأخطار المحتملة في الصناعة النووية. هذا العلاجيقابل من جانب التعرض المزمن للγ للإشعاع بمعدل جرعة مكافئة للسماح مقارنة الصحيحة من أنواع الإشعاع اثنين، وهو أمر حاسم لتقييم فعالية البيولوجية النسبية. يتكون بيتا للإشعاع من إلكترونات، مما يجعلها تختلف كثيرا عن γ للإشعاع، الفوتونات ذات الطاقة العالية. ونتيجة لهذا الاختلاف، Β للإشعاع يمثل خطرا على الصحة في الغالب الداخلي وربما يكون لها آثار بيولوجية مختلفة مقارنة γ للإشعاع. وأسفرت هذه المضاعفات في خلافات كبيرة على تنظيم التعرض لβ-الاشعاع المنبعث من HTO. وهكذا، ومستويات تنظيمية من HTO في المياه الصالحة للشرب للجمهور تختلف من 100 بيكريل / L في أوروبا إلى 75000 بيكريل / L في أستراليا. ولذلك، من المهم للمقارنة التأثيرات البيولوجية للHTO لجرعات يعادل γ للإشعاع. ثانيا، يتم قياس معدل الحمض النووي DSB في splenocytes معزولة عند الانتهاء من التعرض المزمن باستخدام المسمى immunofluorescently γH2AX كشفإد التدفق الخلوي. وهذا يسمح للتقييم مدى التلف في الحمض النووي من قبل في الجسم الحي التعرض الواقع. ومع ذلك، فمن المنطقي أن نتوقع أن مثل هذه التعرضات مستوى منخفض قد لا ينتج أي نسب ملحوظة من الحمض النووي DSB. بدلا من ذلك، بعض التغييرات الخفية / قد يكون من المتوقع من شأنها أن تؤثر على قدرة الخلايا على إصلاح الحمض النووي من التلف الردود. هذه التغيرات، إذا وجدت، قد تكون إما المحفزة (تنتج تأثير مفيد) أو المثبطة (إحداث تأثير ضار). البروتوكول المقترح يسمح تكشف هذه التغيرات من خلال تحدي splenocytes المستخرجة مع جرعة عالية من الإشعاع التي تنتج قدرا كبيرا من الضرر (على سبيل المثال، 2 غراي إنتاج ما يقرب من 50 DNA جهاز تسوية المنازعات في خلية أو 3 – زيادة بنسبة 5 أضعاف في المستوى الإجمالي γH2AX) . وفي وقت لاحق، وتشكيل وفقدان γH2AX، مما يعكس بدء والانتهاء من إصلاح جهاز تسوية المنازعات، ويتم رصد التدفق الخلوي. بهذه الطريقة، ليس فقط القاعدية والمستويات التي يسببها العلاج من الحمض النووي DSB يمكن قياسها، ولكنأيضا تأثيره المحتمل على قدرة الخلايا على الاستجابة وإصلاح الحمض النووي من التلف الناجم عن مستويات الإجهاد أعلى من ذلك بكثير.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الواردة في هذه الورقة هو مفيد لإجراء الماوس على نطاق واسع في الدراسات المجراة دراسة الآثار السامة للجينات من مستويات منخفضة من مختلف العوامل الكيميائية والفيزيائية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة. منشأتنا الحيوانات خالية من مسببات الأمراض محدد فر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).
Materials
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1mg/mL |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm mL uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60x15mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10X Stock, | |||
| 30g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
