Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em> In Vivo</em> A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação
Summary
A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.
Abstract
Exposição à radiação de dose baixa pode produzir uma variedade de efeitos biológicos, que são diferentes em quantidade e qualidade dos efeitos produzidos por doses elevadas de radiação. Abordar questões relacionadas com a segurança da saúde ambiental, ocupacional e público de uma forma adequada e cientificamente justificada depende fortemente a capacidade de medir com precisão os efeitos biológicos de poluentes doses baixas, como as substâncias químicas e radiação ionizante. Danos e reparação do ADN são os mais importantes indicadores precoces de riscos para a saúde devido às suas potenciais consequências a longo prazo, como o cancro. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar o efeito da crônica exposição in vivo a doses baixas de radiação β γ- e sobre os danos e reparação do ADN em células de baço de ratinho. Usando um marcador geralmente aceite de quebras de ADN de cadeia dupla, histona H2AX fosforilada chamado γH2AX, demonstramos como ele pode ser usado para avaliar não só os níveis de danos no DNA, mas também mudana capacidade de reparo do DNA potencialmente produzido por dose baixa em exposições in vivo. A citometria de fluxo permite a medição rápida, precisa e fiável de imunofluorescência marcado γH2AX em um grande número de amostras. ADN de cadeia dupla reparação de quebras pode ser avaliada por exposição esplenócitos extraídos a uma dose desafiadora de 2 Gy de produzir um número suficiente de ADN para provocar quebra reparação e medindo o induzido (1 h pós-irradiação) e danos no ADN residual (24 hrs pós-irradiação). Danos no ADN residual seria indicativo de reparação incompleta e o risco de instabilidade genómica longo prazo e cancro. Combinado com outros ensaios e de pontos finais que podem ser facilmente obtidos em tais estudos in vivo (por exemplo, as aberrações cromossômicas, freqüências de micronúcleos em reticulócitos de medula óssea, a expressão do gene, etc.), esta abordagem permite uma avaliação precisa e contextual dos efeitos biológicos estressores de baixo nível.
Introduction
Controvérsia significativa sobre os potenciais efeitos nocivos, tanto de doses baixas ou muito baixas de radiação e medo do público de radiação, impulsionado por imagens dos bombardeios atômicos de Hiroshima e Nagasaki e de acidentes em usinas nucleares raros ionizante (exacerbada pelos meios de comunicação de massa), tem levado a muito estrita regulação protecção contra as radiações e padrões que não são potencialmente justificada cientificamente. Nas últimas três décadas, numerosos relatórios têm documentado tanto a falta de nocivos e a presença de efeitos biológicos potencialmente benéficos induzidos pela baixa dose de radiação 1-4. O principal fator de risco para a saúde da radiação é a probabilidade de câncer, estimado com base em estudos epidemiológicos de sobreviventes da bomba atômica que receberam doses elevadas ou médias de radiação. Extrapolação linear destes dados (os chamados linear não-limiar ou modelo LNT) é utilizada para estimar os riscos de cancro em doses baixas. No entanto, esta abordagem não tem recebido aceitação científica mundiale é fortemente debatido 5.
É evidente que mais estudos são necessários para esclarecer esta questão e, eventualmente, melhorar os padrões de protecção contra as radiações. Esses estudos devem envolver tratamentos crônicos (melhor aproximação das exposições ambientais e ocupacionais), em modelos animais in vivo (melhor para efeitos para a saúde humana) e extrapolar esses pontos finais como taxas de danos no DNA, reparo do DNA e mutagênese. Sabe-se que o DNA é o alvo principal para efeitos de radiação prejudicial e incompleta ou mis-reparação pode levar a mutagênese e câncer desenvolvimento 6.
ADN quebras de cadeias duplas (DSB) são um dos tipos mais deletérios de lesões do ADN e podem levar a morte celular e a tumorigénese 7. É, portanto, importante ser capaz de medir com segurança e precisão o nível de ORL após a exposição à radiação de baixa dose e / ou outros factores de stress, tais como poluentes químicos. Um dos marcadores mais sensíveis e específicosde DSB de ADN é fosforilado histona H2AX, chamado γH2AX 8, ainda outros marcadores e métodos têm sido sugeridos 9,10. Estima-se que milhares de moléculas de H2AX, na vizinhança de uma DSB induzidos, estão envolvidos na formação de γH2AX possibilitando a detecção de ORL indivíduo por marcação imunofluorescente com um anticorpo e microscopia de fluorescência de anti-γH2AX 11. A resposta é muito rápido, atingindo um máximo entre 30 e 60 min. Existem evidências de que γH2AX facilita o reparo de DNA DSB, atraindo outros fatores de reparação para os sites de pausas e modificando a estrutura da cromatina para ancorar as extremidades do DNA quebrados e fornecer acesso para outras proteínas de reparo (revisto em 12). Após a conclusão do reparo de DNA DSB, γH2AX fica de-fosforilada e / ou sofre degradação, e moléculas H2AX recentemente sintetizadas substituir γH2AX nas áreas afetadas da cromatina 10. Formação e perda de γH2AX Monitoramento pode,portanto, fornecer uma estimativa precisa da cinética de reparo de DNA DSB. Esta abordagem tem sido utilizada para estudar a reparação de DSB em várias linhas celulares tumorais humanas irradiadas com doses elevadas de radiação e a sua taxa de DSB e níveis residuais foram mostrados para correlacionar com radiossensibilidade 13-15.
Nós modificamos essa abordagem experimental e aplicou-a a um estudo de rato in vivo para examinar os efeitos de baixas doses de γ- crônica e β-irradiação sobre os níveis de ADN DSB e reparação (Figura 1). Em primeiro lugar, nós demonstramos um método para executar uma exposição crónica a longo prazo de ratinhos para β-radiação emitida pela ou trítio (hidrogénio-3) sob a forma de água tritiada (HTO) ou como trítio ligado organicamente (OBT) dissolvido na água potável . As duas formas são de esperar a acumulação e / ou distribuir de forma diferente no corpo e, por conseguinte, produzir diferentes efeitos biológicos. Ambas as formas são possíveis riscos na indústria nuclear. Este tratamentoé comparada com a exposição crónica à radiação-γ a uma taxa de dosagem equivalente a permitir uma comparação correcta dos dois tipos de radiação, que é fundamental para a avaliação da sua eficácia biológica relativa. -Radiação Beta é composto de electrões, tornando-se muito diferente da radiação γ, fotões de alta energia. Devido a esta diferença, Β-radiação representa perigo para a saúde na maior parte interna e pode produzir diferentes efeitos biológicos em comparação com γ-radiação. Esta complicação resultou em controvérsias significativas sobre a regulação da exposição a β-radiação emitida pelo HTO. Assim, os níveis regulatórios de HTO na água potável para o público variam de 100 Bq / L na Europa para 75.000 Bq / L na Austrália. É, portanto, importante para comparar os efeitos biológicos de HTO a doses equivalentes de γ-radiação. Em segundo lugar, a taxa de DNA DSB é medido em esplenócitos isolados após a conclusão de exposições crônicas usando imunofluorescência marcado γH2AX detectared por citometria de fluxo. Isto permite a avaliação da extensão do dano do ADN infligido por as exposições in vivo. No entanto, é sensato esperar que tais exposições de baixo nível pode não produzir quaisquer taxas detectáveis de DNA DSB; em vez disso, algumas alterações ocultas / respostas pode-se esperar que afetariam a capacidade das células para reparar danos no DNA. Estas alterações, quando detectado, pode ser ou estimulador (a produção de um efeito benéfico) ou inibidor (que produz um efeito deletério). O protocolo proposto permite revelar tais alterações por desafiar os esplenócitos extraídos com uma dose elevada de radiação que produza uma quantidade significativa de danos (por exemplo, 2 Gy produzindo aproximadamente 50 DSB de ADN por célula ou um 3 -. Aumento de 5 vezes no nível γH2AX total) . Subsequentemente, a formação e a perda de γH2AX, reflectindo o início e conclusão de reparação de DSB, é monitorizada por citometria de fluxo. Desta forma, não só os níveis basais e induzida por tratamento de DSB de ADN pode ser medido, mastambém o seu efeito potencial sobre a capacidade das células para responder e reparar danos ao DNA induzidos por níveis muito mais elevados estressores.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado neste artigo é útil para a realização de rato grande escala estudos in vivo que examinam os efeitos genotóxicos de baixos níveis de vários agentes químicos e físicos, incluindo a radiação ionizante. Nossa biotério livre de patógenos específicos único equipado com um irradiador Gammabeam 150 e um salão de 30 metros de comprimento irradiação permite a realização de estudos ao longo da vida que envolvem irradiações baixa ou muito baixa taxa de dose em centenas ou mesmo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).
Materials
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1mCi/mL (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1mg/mL |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm mL uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60x15mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10X Stock, | |||
| 30g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
