Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da – – hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Sağlam sıralama teknolojileri ve gelişmiş veri analitik araçlar ile tümör genomları detaylı moleküler karakterizasyonu belirli kanser türleri 1,2 anahtar genetik değişikliklerin keşfine yol açmıştır. Böyle HER2, BCR-ABL, EGFR ve ALK olarak bu genetik lezyonlar, amaçlayan hedefli tedavilerin geliştirilmesi, önemli ölçüde hastalar 1,2 yaşam kalitesini artırmıştır. Direnç sonuçta ortaya Ancak, bu yaklaşımın özgüllük rağmen, çoğu tek tedavilere klinik yanıt sub-optimal olmuştur. Son zamanlarda, önemli ilerlemeler hedeflenen terapötiklere direncinin moleküler temellerinin anlaşılmasında yapılmamıştır. Şaşırtıcı, bu direniş önemli bir mekanizma sürekli hedef / yolu aktivitesini içerdiğini açıkça hale gelmektedir. Noktada bir olgu olarak, androjen reseptörü (AR), prostat kanserinin tedavisi enzalutamide, AR kendisi aktive edici mutasyonlar muhafaza zenginleşmesine yol açar -directed AR-sinyal outpönleyicisi 3-5 mevcudiyetinde ut. Bu bilgi de WT ve mutant-AR fonksiyonu hem de bastırmaya devam edebilirsiniz üçüncü nesil antagonistleri geliştirilmesi) 1 saldırgan bir kampanya açmıştır enzalutamide dirençli PKa 3 ve 2) terapötik müdahale için hedeflenmiş olabilir AR sinyalizasyon potansiyel aşağı düğümleri tespit . Benzer şekilde, EGFR BRAF ve ABL hedef gibi inhibitörlerinin diğer sınıflara karşı direnç genellikle orijinal addicting kinaz yolunu 1 etkinleştirebilirsiniz mutasyonlara yol açar.
Direniş kaçınılmaz hastaların çoğunda ortaya çıktığını bilgi ile, yaklaşımlar geliştirmek süratle etkin takip tedavilerin gelişimini sağlayacak ışık bu mekanizmaları getirmek. Yaygın olarak kullanılmakta olan bir yaklaşım d mükellef olabilir genetik lezyonlar zenginleşme / tüketilme tanımlamak için göreceli tedavi görmemiş veya -duyarlı tümörlerin klinik refrakter tümörlerin genomiğini analiz etmektirhalı keşif. Onun söze rağmen, hızlı keşif engel bu yaklaşımın iki önemli yükümlülükleri vardır. Öncelikle, genomik sorgulama için tümör malzemeye zamanında erişim sağlamasını tedavi terapi hareket önemli bir engel olarak hizmet edebilir. Tümörler belirgin intra-tümöral heterojenliğini 6,7 sunabilirim çünkü İkincisi, dirençli bir ortamda genetik lezyonların sayısız Dekonvolüsyonun zor olabilir.
Bu zorlukların ışığında, direnç mekanizmaları preklinik keşif bağımlılığı var artmıştır. Bu yaklaşım önce direnç başlangıcından şu bu mekanizmaları ya tedaviden önce veya ayı hastalarda alternatif klinik yönetim stratejilerini yol gösterici olabilir klinik çalışmalarda 1 öne direnç mekanizmalarını tanımlanmasına izin verebilir.
Yaygın olarak kullanılıyor Böyle bir klinik öncesi keşif aracı tarafsız fonksiyonel RNAi ekranları uygulamaktır. Sınavaple, Whittaker ve arkadaşları NF1 kaybı sürekli MAPK yolu aktivasyonu ile 8 RAF ve MEK inhibitörlerinin direnç aracılık ettiğini belirlemek için bir genom ölçekli RNAi ekran uyguladı. NF1 kayıp-fonksiyon mutasyonları RAF inhibisyonuna ve aktivasyonunu 8 vemurafenib dirençli melanoma tümörlerinin in dirençlidir BRAF -mutant tümör hücrelerinde gözlenmiştir Bu bulgular klinik olarak önemli olduğu bulunmuştur. Ancak, bu yaklaşımın başarısı rağmen, birçok klinik açıdan anlamlı hedefler genellikle muhtemelen nedeniyle bu yaklaşımın kaybı fonksiyon-önyargı tespit edilmemiştir.
Bunun aksine, direnç mekanizmalarının klinik öncesi keşfi için daha az eğilimli bir araç NGS bazlı genomik veya transkriptomik profil ile birlikte ilgi bileşiğe uzun süre maruz kaldığında dirençli hücre hatlarının üretilmesini içerir. Bu yaklaşım başarılı kendiliğinden tespit için çeşitli gruplar tarafından uygulamaya konmuşturdirenci 5,9,10 sağlayan tekrarlayan tek nükleotid varyantları veya ifade değişiklikler. Örneğin, AR tekrarlayan F876L mutasyonu son in vitro 3-5 dirençli klonlar ve klinikte 4 öncesinde, bu mutasyonun belirlenmesi için, in vivo olarak 5 ksenograft tümörlerinin keşfedilmiştir. Çok yakın bir zamanda, Bhang ve arkadaşları çoğu, fonksiyonel olarak bağlantılı mutasyonlar düşündüren, önceden varolan bir alt populasyonun bir parçası olan uzun süreli ilaç maruziyeti sırasında ortaya çıkan dirençli klonların çoğunluğunun göstermek için iki klinik olarak anlamlı bir model ClonTracer kullanılan (2015) 11, önceden mevcut olan daha önce muhtemeldir Bu seçim sırasında 11 için seçilen hale gelir.
Daha önce de tartışıldığı tümörlerin genomik profile Tersine, daha az heterojenlik Bu yaklaşımın yararları "homojen" dirençli klonlar, potansiyel sürücüsü daha doğru bir genetik diseksiyon kolaylaştırmak analizi için kullanılan gibidir. FurthermCevher, heyecan, direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak için potansiyel ek olarak, bu yöntem, bu bilgilerin bilinmiyor 10 olduğu biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hücresel etki mekanizmaları ve hedeflerini tanımlamak için uygulanabilir. Net avantajları ve bu yaklaşımın birden kullanımları göz önüne alındığında, burada klinik olarak anlamlı keşifler potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için böyle bir preklinik ekranın başarılı bir şekilde uygulanması ayrıntılı bir protokol mevcut.
Hücre çizgisi (ler) in seçimi: Genetik durumuna ve genomik instabilite karakterizasyonu
Kuşkusuz, başarılı klinik olarak anlamlı direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak tek ve en önemli faktör ilk hücre çizgisi seçimidir. Iki faktör dikkate alınmalıdır. Birincisi, hastalığın tanımlanması, genetik özelliklerini barındıran, aynı soy / alt tipinin hücre çizgisi (ler) i seçmek hedefliyoruz (örn., Melanom BRAF V600E). Endikasyonlar 33,34 çeşitli hem hücre hatları ve primer 30-32 / metastaz tümörlerin kamuya açık transkriptomik ve mutasyon veri Sorgulama seçim sürecini kolaylaştırır. Klinik olarak ilgili genetik değişiklikler hücre hatlarının tespiti doğru olmasına rağmen, bazı durumlarda bu durum böyle bir tarama işleminin zorluğu ve uzunluğu gibi faktörler nedeniyle mevcut hücre çizgilerinin eksikliği ya da mümkün mümkün olmayabilir.
<p class="jove_content"Söz konusu noktaya getirmedi, ikinci faktör hücre hattı seçimi sırasında daha sonra dikkate> kolaylığı veya istenilen hattı kullanarak tarama direnç fizibilite olduğunu. Örneğin, bu tür proliferasyon ve içsel mutasyon oranları gibi faktörler büyük keşif hızına etkileyebilir. Bu amaçla, hücre çizgileri kendiliğinden direncinin ortaya çıkması 35 hızlandırılabilir umuduyla DNA MMR mekanizmalar hızlı büyüme kinetikleri ve noksan olan kullanılabilir. KOZMIK veri tabanına dayanarak, pek çok aday hücre çizgileri, iki 'sıklıkla mutasyon geçiren MMR genleri, Msh2 ya MLH1 birinde eksikliği mevcuttur (Tablo 2 ve 3). Ilgi hücre çizgileri, alkile edici ajan olarak MMR fiziksel ya da DNA reaktif kimyasal bir mutajen ile akut tedavisinde rulman kusurları mevcut olmayan, alternatif olarak, N-etil-N -nitrosourea (TRK), genomik instabilite geliştirmek için de kullanılabilir. Her ne kadar olabilir önemli ölçüde s her iki yaklaşımdirençli klonlar ulaşmak ve takip sıralama için zaman Horten, sıkı fonksiyonel test işlevsel olmayan daha büyük bir sayı olarak aday genler üzerinde yapılmalıdır, yolcu mutasyonlar ortaya çıkması muhtemeldir. SNVs işlevsel ilgili mutasyonları tanımlamak için şansını maksimize etmek emretti rütbe olabilir. Birincisi, seçme bağımsız klonlar Tekrarlayan olan bu mutasyonlar bu mutasyonlar direniş sürücüler olasılığını artıracaktır. Durumunda tekrarlayan mutasyonlar ilacın aksiyon mekanizması uygun SNVs odaklanan tespit değildir (örneğin, bir ilaç ya da ilaç hedefi hedef bilinen bir alt baş efektör) anlamlı olabilir. Sonuçta, altın standart her zaman ilaca duyarlı ebeveyn hücrelerde ektopik cDNA ifadesi ile aday SNVs bir direnç veren aktivitesinin deneysel değerlendirilmesidir.RNA sıralama vs DNA
Bir kez dirençli klonlar, oluşturulan DNA ve / veya RNA edilmiştirihtiyaca bağlı olarak dizilebilir. DNA dizi analizi, exome veya tüm genom dizileme de böyle SNP, indellerin olarak germ ve somatik varyantları, tanımlanmasını sağlayacak ve sayı varyantları kopyalar. Üreten bilinen kodlama bölgelerden gelen okur üzerinde daha maliyet-dostu exome sıralama odaklanır Oysa, bütün genom dizileme gibi arttırıcı veya miRNA'lar 36 olarak kodlayıcı olmayan elemanların mutasyonların belirlenmesi kolaylaştırabilecek tüm genom dizileme için veri üretecektir. Gen ekspresyonu verileri DNA dizilemesi sırasında teraziye olmadığı için, ancak, hangi mutasyon (lar) bir fonksiyonel sürücüsü olması muhtemeldir tahmin etmek zordur. Bu bağlamda, RNA dizi analizi, her ne kadar daha fazla maliyetli olarak, bu bir avantaj sunar. Mutasyon arama yalnızca İfade edilen RNA türleri üzerinde gerçekleştirilen olması ilgi mutasyonu fonksiyonel bir sürücü olması olasılığını da artırmaktadır. Izlem fonksiyonel test, aynı zamanda RNA sıralama için mutasyon daha odaklı bir anket sağlayan ek olarakAyrıca direniş gibi güçlü sürücüleri hizmet verebilir gen füzyonları dahil gen ifadesi değişikliklerini, alternatif bağlantı ve yeni kimerik RNA türlerinin, tespit edememek ekledi avantajı sunuyor.
Biyoinformatik boru hattı
Örnek komutları gösterim amaçlı verilmiştir, fakat daha ayrıntılı belgeler ve öğreticiler Enstitüsü 16 Geniş temin edilebilir ve NGS analizi başlamadan önce iyice okunmalıdır. Aşağıdaki komutlar tüm araçlar ve referans verileri önceden yüklenmiş olduğu bir sistemde bir UNIX kabuk ortamı için tasarlanmıştır. Bu komutlar ayrıca fastq dosyaları içeren paired-end dizisi "ebeveyn" ve "dayanıklı" satıcıdan alınan ve "data" dizininde konuldu adında iki örnek okur varsayıyorum. Çoğu durumda bu komutlar adapte edilmelidir veya ek komut satırı arg kullanarak belirli bir uygulama için optimizeuments (örneğin, bwa komutuna "-t 8" ekleyerek 8 CPU çekirdeği arasında okuyuculu çalışmasını sağlar). Bam dosya başına yalnızca bir örnek belirli araçlar için dosya formatı gereksinimlerine uymak için, olsa bile (biyolojik örnekler için hizalamalarını atamak) Okuma grupları, sık sık BAM dosyalarına eklenmesi gerekir. Grup parametreleri RGID, RGSM, RGPL, RGPU okuyun ve RGLB keyfi örnek adını açıklayan dizeleri, sıralama platformu ve kütüphane strateji olabilir.
In vivo deneyler vs in vitro
In vitro seleksiyon tarafından belirlenen çeşitli direnç mekanizmaları klinik olarak anlamlı olduğu doğrulanmış olmasına rağmen, mekanizmalar, klinik direnç alakalı ya da baskın mekanizmaları hizmet olmayabilir bir olasılık söz konusudur. Bunun bir nedeni, tedaviye direnç sürüş mikro çevre için önemli bir rol, deneysel protokol / ayar d yoksun olan bir bileşeni de içerebilirŞimdiye kadar iscussed. Gerçekten de, bazı çalışmalar tümör hücrelerinin stroma 37,38 ile sağlanan direnci doğal mekanizmalar ima stromal hücrelerin varlığında kültürlenir zaman tümör hücrelerini öldürme yeteneğine sahip anti-kanser maddeler etkisiz hale olduğunu göstermiştir. Böyle stroma kaynaklı kazanılmış direnç mekanizmalarını tanımlamak için, bir in vitro ko-kültür veya in vivo tümör direnci deneyleri performans düşünebilirsiniz. Eski tahlil oldukça karmaşık olduğundan, pek çok direnç sürüş stromasında potansiyel rolünü ele ilaca dirençli tümör xenografts üreten başvurdular. Bu tür çalışmalar, stroma gerçekten de ikinci bir rol oynayabileceğini ima in vitro seçime direnci nisbetle iki özdeş 5 ve eşsiz 39 mekanizmaları ortaya çıkardı. Ancak, bir böyle dirençli tümörleri üretmek için sürebilir sürenin uzunluğu ve takip genomik analiz-complexitie karmaşıklığı dikkatli olmalıdırintra-tümöral moleküler ve hücresel heterojenliği nedeniyle s.
Hedef tanımlama
Ilaç direnç mekanizmalarının açığa çıkarmak için ek olarak, bu NGS bazlı genomik profil yaklaşım aynı zamanda, kimyasal probların hücresel hedefleri tespit etmek uygulanabilir. Tarihsel olarak, birden fazla tarafsız yöntemler Kantitatif proteomik ile birleştiğinde afinite temizliği, maya genomik yöntemler, RNAi tarama ve bilgisayar çıkarım 40 yaklaşımlar da dahil olmak üzere biyolojik aktiviteleri, düşük molekül ağırlıklı kimyasal maddelerin hücresel etki mekanizmaları ve hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bileşiklerin fonksiyonel hücresel hedeflere içgörü sunabilir direnci sağlayan fenotipik dirençli hücre popülasyonlarının, benzersiz tekrarlayan tek nükleotid değişimleri (SNVs) veya ifade değişikliklerinin tanımlanması NGS merkezli genomik veya transkriptomik profilleme kullanarak ilaç direnç mekanizmalarının aydınlatılmasında bir uzantısı olarak. TOnun görülen direnç mekanizmalarının bir alt kümesi, küçük molekülün, doğrudan protein hedefleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, tekrarlayan içerebilir fikrine dayanmaktadır. Son zamanlarda, birçok rapor, özellikle 9,10 sondalar küçük molekülün hücresel hedefleri ortaya çıkmasına, büyük ölçekli kanser hücre hattı hassasiyeti profil dahil olmak üzere diğer yaklaşımlarla birleştirerek, yaklaşım programı onayladı.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |