임상 증상은 다음 이전에 또는에 – – 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
강력한 시퀀싱 기술과 향상된 데이터 분석 도구에 의한 종양 게놈의 상세한 분자 특성은 특정 암 유형 1, 2의 주요 유전 적 변화를 발견하게되었다. 이러한 HER2, BCR-ABL, EGFR과 ALK 이러한 유전 적 병변을 목표로 표적으로 한 치료의 개발은 크게 환자의 1, 2의 삶의 질을 향상되었습니다. 저항 궁극적 나온다 그러나, 이러한 접근법의 특이성에도 불구하고, 대부분의 단일 요법에 대한 임상 적 반응은 차선왔다. 최근에 상당한 진전이 표적 치료제에 대한 내성의 분자 토대 이해에서했다. 흥미롭게도, 그것은 저항의 눈에 잘 띄는 메커니즘이 지속적으로 목표 / 경로의 활동을 포함하는 것이 분명 해지고있다. 점의 경우로, 안드로겐 수용체 (AR)은 전립선 암의 enzalutamide 치료, AR 자체의 돌연변이를 활성화 유지의 농축에 이르게 -directed AR-신호 OUTP3-5 억제제의 존재 하에서 UT. 이 지식에 WT 및 돌연변이 AR 기능을 모두 억제을 계속할 수 있습니다 제 3 세대 길항제를 개발) 1 공격적인 캠페인을 주도하고있다 enzalutamide 방지 PCA 3, 2) 치료 적 개입의 대상이 될 수있다 AR 신호의 잠재적 인 다운 스트림 노드를 식별 . 마찬가지로, EGFR, BRAF 및 ABL을 대상으로 그 억제제의 다른 클래스에 대한 저항은 종종 원래의 중독성 키나제 경로 (1)를 활성화 돌연변이로 이어집니다.
저항은 필연적으로 대부분의 환자에서 출현하는 지식, 방법을 개발하는 것은 신속하게 효과적인 후속 치료의 개발을 허용합니다 빛에 이러한 메커니즘을 가지고있다. 널리 사용되는 한 가지 방법은 D 의무가 될 수있다 유전 적 병변에서 부화 / 고갈를 식별하기 위해 상대적으로 치료 순진 또는 민감한 종양에 대한 임상 난치성 종양의 게놈을 분석하는 것입니다양탄자 발견. 약속에도 불구하고, 빠른 검색을 방해이 방법의 두 가지 책임이 있습니다. 첫째, 게놈 심문에 대한 종양 물질에 적시에 액세스를 얻는 것은 치료 요법에서 이동에 큰 장애물이 될 수있다. 종양이 중요한 내 종양 이질성 6,7를 제공 할 수 있기 때문에 두 번째로, 저항 설정에서 유전 적 병변의 무수한의 디컨 볼 루션 도전 할 수있다.
이러한 문제의 관점에서, 저항 메커니즘의 임상 발견에 대한 의존도가 증가되었습니다. 이 방법은 이전의 저항의 발병 다음 이러한 메커니즘 중 하나 이전에 치료 또는 곰 환자에서 다른 임상 관리 전략을 안내 할 수있는 임상 시험 (1)에 눈에 띄는 저항 메커니즘의 식별을 허용 할 수있다.
널리 사용되는 한 이러한 전임상 검색 도구는 편견 기능의 RNAi 화면을 적용하는 것입니다. 시험을위한PLE, 휘태커와 동료 NF1 손실이 지속 MAPK 경로 활성화 (8)를 통해 영국 공군 및 MEK 억제제에 대한 내성을 매개 것을 식별하기 위해 게놈 규모 RNAi의 화면을 적용했다. NF1의 기능 상실 돌연변이가 RAF 억제 및 활성화 8 vemurafenib 내성 흑색 종 종양에서 본질적 내성 BRAF -mutant 종양 세포에서 관찰 된 이러한 결과는 임상 적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 그러나,이 접근법의 성공에도 불구하고, 많은 임상 적으로 관련된 표적은 종종 추측 때문에이 방식의 기능 상실 바이어스 식별되지 않는다.
반대로, 저항 메커니즘 전임상 발견을위한 덜 바이어스 도구 NGS 기반 게놈 또는 transcriptomic 프로파일과 함께 관심있는 화합물을 장기간 노출을 통해 내성 세포주의 생성을 수반한다. 이 접근법은 성공적 자발 식별 몇몇 그룹에 의해 구현 된저항 5,9,10 수 있도록 재발 단일 염기 변형 또는 식 변경. 예를 들어, AR의 재발 F876L 돌연변이는 최근 체외 3-5에 저항하는 클론과 병원 4 이전에이 돌연변이의 식별에 생체 5 이종 이식 종양에서 발견되었다. 아주 최근에, Bhang와 동료 대부분의 기능 관련 돌연변이를 제안 기존의 모집단의 일부 장기간 약물 노출시 발생하는 저항하는 클론의 대부분을 보여주기 위해 두 개의 임상 적 모델 ClonTracer을 사용 (2015) (11)는 사전에 기존의 이미 가능성 즉 선택 (11) 중 선택이된다.
앞서 논의 종양 게놈 프로파일과는 대조적으로, 이하에서 이질성이 방법의 이점은 "균질"내성 클론 전위 드라이버보다 정확한 유전 절개를 용이 분석에 사용 된 바와 같다. Furtherm철광석은 호쾌 저항의 메커니즘을 밝혀위한 전위에 더하여,이 방법은이 정보를 알 수 10되는 생체 활성 작은 분자의 세포 작용 메커니즘과 목표물을 식별하기 위해 적용될 수있다. 명확한 장점과이 방법의 여러 용도로 주어진, 우리가 임상 적으로 의미 발견 가능성을 최대화하기 위해 이러한 전임상 화면의 성공적인 구현을 자세하게 프로토콜을 제시한다.
세포주 (들)의 선택 : 유전 적 상태와 게놈 불안정성의 특성
의심 할 여지없이 성공적으로 임상 적으로 관련된 저항 메커니즘을 밝혀에서 가장 중요한 요소는 초기 셀 라인 선택이다. 두 가지 요소가 고려되어야한다. 첫째, 질병의 정의 유전 적 특성을 품고 같은 혈통 / 하위 유형의 세포 라인 (들)을 선택하는 것을 목표로 (예., 흑색 종에서 BRAF V600E). 표시 (33, 34)의 양쪽 다양한 세포주 및 일차 30-32 / 전이 종양 공개적 사용할 transcriptomic 돌연변이 데이터 질의는 선택 프로세스를 용이하게한다. 임상 적으로 중요한 유전 적 변형을 가진 세포주의 식별이 이상적이지만, 경우에 따라서 이는 이러한 스크리닝 프로세스의 난이도 및 길이 등의 요인으로 인해 가능한 세포주의 부족 또는 실현하는 것이 가능하지 않을 수도있다.
<p class="jove_content"상술 한 점에 관해서, 두 번째 인자는 세포 라인 선택시 고려해야 할 다음>하기 쉽게하거나, 원하는 라인을 이용하여 스크리닝 저항의 가능성이다. 예를 들어, 증식 및 극한 돌연변이율 같은 요인은 크게 검색의 속도에 영향을 줄 수있다. 이를 위해, 세포주 자발적인 내성 출현 35 가속화 될 수 있다는 희망 DNA MMR 기법의 빠른 성장 동역학 및 결실로 이용 될 수있다. COSMIC 데이터베이스에 기초하여, 여러 후보 세포주 두 자주 돌연변이 MMR 유전자, MSH2 MLH1 또는 결핍 중 하나에 존재한다 (표 2 및 3). 관심 세포주는 알킬화제로서 MMR, 물리적 또는 DNA 반응성 화학적 돌연변이 유발 급성 치료 베어링 결함이 존재하지 않는 경우 또는, N – 에틸 – N의 -nitrosourea (ENU)는 게놈의 불안정성을 개선 할 수있다. 비록 수도 크게이야 두 가지 방법내성 클론을 획득 및 추적을 시퀀싱하는 시간을 호르 텐, 엄격한 기능 테스트는 비 기능의 더 큰 수와 후보 유전자에서 수행해야 승객 돌연변이 출현 할 가능성이있다. SNVs 기능적으로 관련된 돌연변이를 식별 가능성을 최대화하기 위해 순위가 될 수있다. 첫째, 선택은 독립적 인 클론에 재발되어 그 돌연변이는 이러한 돌연변이가 저항의 드라이버입니다 가능성을 높일 것입니다. 이벤트 재발 돌연변이 약물의 작용 메커니즘에 초점을 맞춰 SNVs, 식별되지 않은 (예를 들면, 약물 또는 약물 표적 대상물의 공지 하류 이펙터) 의미가있을 수있다. 궁극적으로, 황금 표준은 항상 약물에 민감한 부모의 세포에서 자궁외의 cDNA 발현에 의해 후보 SNVs의 저항 부여 활동의 실험적인 평가입니다.RNA 서열 대 DNA
일단 내성 클론을 생성하는 DNA 및 / 또는 RNA되었습니다필요에 따라 순서가 될 수있다. DNA 염기 서열, 엑솜 또는 전체 게놈의 염기 서열 중 하나는, 이러한 SNP를, 삽입과 삭제 등의 생식 세포와 체세포 변이의 식별을 허용하고 번호가 변형 복사합니다. 생성 알려진 코딩 영역에서 읽고에 더 많은 비용 친화적 인 엑솜 시퀀싱이 초점을 맞추고있는 반면, 전체 게놈 시퀀싱은 증강 또는 miRNA가 36 비 코딩 요소의 돌연변이의 식별을 용이하게 할 수는 전체 게놈 염기 서열 데이터를 생성합니다. 유전자 발현 데이터는 DNA 시퀀싱 동안 계측되지 않으므로, 어떤 돌연변이 (들)의 기능 드라이버 될 가능성을 예측하는 것이 곤란하다. 이와 관련, RNA의 염기 서열, 비록 비용이 많이 드는,이 장점을 제공합니다. 돌연변이 호출에서만 발현 RNA 종에서 수행된다는 사실은 관심의 돌연변이는 기능적 드라이버 일 수있는 가능성을 향상시킨다. 후속 기능 테스트, 또한 RNA 시퀀싱 돌연변이 더 집중 조사를 허용 이외에또한 저항과 같은 강력한 드라이버 역할을 할 수있다 유전자 융합을 포함하여 유전자 발현의 변화, 대체 접합 및 새로운 키메라 RNA 종을 식별 할 수있는 장점을 제공합니다.
생물 정보학 파이프 라인
예 명령을 예시하기위한 것이며, 그러나 더 자세한 설명서와 자습서 연구소 16 넓은에서 사용할 수 있으며, NGS 분석을 시작하기 전에 반드시 숙지해야한다. 다음 명령은 모든 도구와 참조 데이터가 사전 설치되어있는 시스템에서 UNIX 쉘 환경을 위해 설계되었습니다. 이 명령은 또한 FASTQ 파일을 포함하는 한 쌍의 엔드 시퀀스는 "부모"와 "저항"공급 업체로부터 수신 "데이터"디렉토리에 배치 된 이름, 두 샘플에서 읽어 가정합니다. 대부분의 경우, 이들 명령은 적응되어야하거나 추가 명령 줄 인자를 사용하여 특정 애플리케이션에 대해 최적화색인 처리 (예를 들면, 광대역 무선 접속 명령에 "-t 8"을 추가하면 8 개의 CPU 코어를 통해 다중 스레드 작업을 할 수 있습니다). BAM 파일 당 하나의 샘플은 특정 툴에 대한 파일 포맷 요구 사항을 준수하기 위하여,이 경우에도 (생물학적 시료에 정렬을 할당) 판독 기는 종종 BAM 파일에 추가되어야한다. 그룹 매개 변수 RGID, RGSM, RGPL, RGPU을 읽고 RGLB 임의의 샘플 이름을 설명하는 문자열, 시퀀싱 플랫폼 및 라이브러리 전략이 될 수 있습니다.
생체 분석 대 체외에서
체외 선택에 의해 식별 여러 저항 메커니즘 임상 관련성이 확인되었지만, 메커니즘 임상 저항의 관련성 또는 주된 메카니즘을 제공하지 않을 수 있다는 가능성이 존재한다. 그 이유 중 하나는 치료에 저항 구동의 미세 환경의 중요한 역할, 실험 프로토콜 / D에 설치 결여 성분을 포함 할 수있다지금까지 iscussed. 실제로, 몇몇 연구는 종양 세포가 기질 37,38 의해 부여 저항 타고난 메커니즘을 의미 기질 세포의 존재하에 배양 된 경우 종양 세포를 죽일 수있는 항암제 비효율적 렌더링되는 것을 보여 주었다. 이러한 기질에 의한 인수 저항 메커니즘을 식별하기 위해, 하나는 시험 관내 공동 문화 또는 생체 내 종양 저항 분석법을 수행하는 것이 좋습니다 수 있습니다. 전자의 분석이 매우 복잡하기 때문에, 많은 저항 구동의 기질의 잠재적 역할을 해결하기 위해 약물 내성 종양 이종 이식을 발생에 의존하고있다. 이러한 연구는 기질 실제로 후자의 역할을 할 수 있음을 암시 체외 선택에 대한 저항성에 대하여 모두 동일한 5 및 39 독특한 메커니즘을 밝혀냈다. 그러나, 하나는 이러한 내성 종양을 생성하기 위해 취할 수있는 시간과 후속 게놈 분석-complexitie의 복잡성 염두해야인트라 종양 분자 세포 이질성으로 인해 S.
대상 식별
약물 내성 메카니즘 잠복 외에도이 NGS 기반 게놈 프로파일 링 방법은 또한 화학 프로브의 표적 세포를 식별하기 위해 적용 할 수있다. 역사적으로, 복수의 바이어스 방법은 정량적 프로테오믹스 결합 친 화성 정제, 효모 게놈 방법, RNAi의 선별 및 계산 추론 40 접근법을 포함한 생물학적 활성을 가진 저 분자량의 화학 물질의 세포 작용 메커니즘과 목표물을 식별하기 위해 사용되어왔다. 화합물의 기능 세포의 목표에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 저항을 사용 표현형 내성 세포 인구, 고유의 재발 단일 염기 변이 (SNVs) 또는 발현 변화의 식별 NGS 기반 게놈 또는 transcriptomic 프로파일을 사용하여 약제 내성 메커니즘의 해명에 대한 확장으로. 티그의 관찰 저항 메커니즘 서브셋 소분자의 직접 표적 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 재발 수반 할 수 있다는 생각에 기초한다. 최근, 몇몇보고 특히 9,10 프로빙 소분자의 세포를 대상으로 드러내는, 대규모 암 세포주 감도 프로파일 링을 포함하여 다른 방식으로 조합함으로써, 방법의 유용성을 확인.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |